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Title Page

Abstract

Contents

Chapter 1. Introduction 12

1.1. Cancer immunotherapy 12

1.2. Extracellular vesicles 15

1.3. Immune cell-derived extracellular vesicles 17

1.4. Surface engineering of extracellular vesicles 18

Chapter 2. Material and Methods 23

2.1. Cell culture 23

2.2. Macrophage polarization and EV isolation from cell culture media 23

2.3. Transient transfection for preparation of lentivirus 24

2.4. Preparation of M1EV-IL2 constructed through endogenous modification 24

2.5. Preparation of DBCO-IL-2 for click chemistry reaction 25

2.6. Metabolic glycoengineering of macrophage to obtain M1EV-IL2 constructed through click chemistry reaction 25

2.7. Insertion of DSPE-PEG-N₃ into M1EV for the construction of M1EV-N₃ before the click chemistry reaction 25

2.8. Characterization of M1EV and M1EV-IL2 26

2.9. Reprogramming function of M1EV and M1EV-IL2 26

2.10. Activation function on CD4+ T cells induced by M1EV and M1EV-IL2 27

2.11. Proliferation and activation functions on CD8+ T cells induced by M1EV and M1EV-IL2 27

2.12. RNA isolation, cDNA synthesis and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis 27

2.13. Statistical analysis 28

Chapter 3. Results and Discussion 31

3.1. Genetically modification through lentiviral transduction to obtain M1-type macrophage-derived extracellular vesicles with surface-displayed IL-2 31

3.1.1. Polarization and infection by lentiviruses of M1-type macrophage 31

3.1.2. Isolation of M1EV-IL2 constructed through genetic modification 34

3.1.3. Characterization of M1EV-IL2 constructed through genetic modification 35

3.2. Directly modification through chemical engineering to obtain M1-type macrophage-derived extracellular vesicles with surface displayed IL-2 38

3.2.1. Metabolic glycoengineering of macrophages through the treatment of Ac4ManNAz and polarization into M1-type macrophages 38

3.2.2. Characterization of M1EV-IL2 constructed through metabolic glycoengineering and click chemistry reaction 40

3.3. Directly modifying agents through lipid insertion into EV membrane to obtain M1-type macrophage-derived extracellular vesicles with surface-displayed IL-2 43

3.4. Reprogramming function of M1-type macrophage-derived extracellular vesicles with surface-displayed IL-2 44

3.5. CD4+ T cell activation function of M1-type macrophage-derived extracellular vesicles with surface displayed IL-2 48

3.6. CD8+ T cells proliferation and activation functions of M1-type macrophage-derived extracellular vesicles with surface displayed IL-2 48

Chapter 4. Conclusion 53

References 55

국문초록 64

List of Tables

Table 2.1. Primer sequence for qRT-PCR analysis 29

List of Figures

Figure 1. Schematic of composition of immune cells in tumor microenvironment [4]. M2-type tumor-associated macrophages (TAMs) are abundant and pivotal in the tumor microenvironment (TME), whereas T cells and M1-type macrophages are depleted. The non-immunogenic... 14

Figure 2. Schematic of extracellular vesicles as key player of intercellular communication [25]. Extracellular vesicles (EVs) contain a diverse range of bioactive molecules, such as lipids,... 16

Figure 3. Various strategies for engineering EVs to enhance therapeutic effects [55]. The current emphasis in preclinical research largely centers on augmenting their application through various engineering approaches. These approaches encompass genetic engineering, membrane... 21

Figure 4. Schematic of constructing M1EV-IL2 and evaluating the functions of macrophage reprogramming and T cells (CD4+ and CD8+) activation. Multi-functional EVs were constructed by surface-modifying IL-2, which has T cells activation function, on M1EV, which has a... 22

Figure 5. The process of lentiviral transduction and the selection of infected monocytes. (A) Lentiviruses, generated by transfecting HEK293 cells with a lentiviral transfer plasmid containing... 32

Figure 6. Polarization and IL-2 mRNA expression of infected M1-type macrophages. THP-1 cells, selected with puromycin, underwent differentiation into macrophages following PMA treatment.... 33

Figure 7. Isolation of EVs from normal and infected M1-type macrophages. (A) Illustration of M1EV derived from infected M1-type macrophages, denoted as M1EV-IL2, produced through endogenous modification. EVs were isolated from (B) normal M1-type macrophages... 36

Figure 8. Characterization of M1EV-IL2 construction through genetic modification. For size information analysis, NTA was employed to measure (A) size distribution, (B) concentration, and... 37

Figure 9. Metabolic glycoengineering through the treatment of Ac4ManNAz on macrophages and polarization into M1-type macrophages. (A) Illustration of M0 macrophage treated with Ac4ManNAz. (B) Schematic of EDC/NHS reaction to construct DBCO-IL-2. (C) The expression... 39

Figure 10. Isolation of EVs derived from metabolic engineered M1-type macrophage after click chemistry reaction. (A) Schematic of M1EV-IL2 derived from M1-type macrophages labeled with an azide group. (B) M1EV and M1EV-IL2 were concentrated and purified through... 41

Figure 11. Characterization of M1EV-IL2 constructed through metabolic glycoengineering and click chemistry reaction. For size information analysis, NTA was employed to measure (A) size... 42

Figure 12. Lipid insertion into EV membrane to obtain M1EV-IL2. (A) Schematic of the insertion of DSPE-PEG-N₃ into M1EV. The results of NTA analysis of M1EV and M1EV-IL2 are the results of (A, C) size distribution, (B, D) concentration. 45

Figure 13. Characterization of M1EV-IL2 constructed through lipid insertion. For size information analysis, NTA was employed to measure (A) mean size for both M1EV and M1EV-... 46

Figure 14. Reprogramming function of M1EV and M1EV-IL2. (A) Schematic of the reprogramming of M2-type macrophage into M1-type macrophage. RT-PCR was performed for analysis to confirm the relative expression of (B, C) M1 marker and (D)M2 marker. Polarization into... 47

Figure 15. CD4+ T cells activation function of M1EV-IL2. (A) Schematic of CD4+ T cell activation by M1EV-IL2. (B) RT-PCR was performed for analysis to confirm the relative... 50

Figure 16. CD8+ T cells proliferation function of M1EV-IL2. (A) Schematic of CD8+ T cell activation. (B) WST-1 assay was performed for analysis to confirm the proliferation function by... 51

Figure 17. CD8+ T cells activation function of M1EV-IL2. (A) RT-PCR was performed for analysis to confirm the relative expression of activation markers. (B)The quantity of the T cell... 52

초록보기

 암을 치료하기 위해 암세포를 직접적인 타겟으로 하지 않으며 면역 반응을 강화하여 부작용을 최소화하는 면역치료가 유망한 전략이 될 수 있다. 이때 면역반응을 강화하기 위해서는 암 미세환경을 개선하는 것이 하나의 전략이 될 수 있다. 세포밖소포체는 모세포의 특징을 반영하여 세포 간 통신을 담당하며, 특히 면역세포는 종양의 진행을 억제하고 면역 조절 작용을 자극을 위해 세포밖소포체를 방출한다고 알려져 있다.

본 연구에서는 다양한 방법으로 염증성 대식세포 유래 세포밖소포체(M1EV) 표면에 인터루킨-2(IL-2)를 표지하여 암 면역치료제로써 제안하고 있으며, 이는 암 미세환경에서 상대적으로 고갈된 염증성 대식세포(M1)및 T 세포를 확장하고자하였다. 세포밖소포체를 얻기 위한 세포로는 종양의 성장을 억제할 수 있다고 알려진 염증성 대식세포를 선택하였다. 추가적인 변형으로는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 사이토카인을 세포밖소포체 표면에 표지 하였다. 따라서 M1EV 를 기반으로 하여 종양관련 대식세포(M2)를 염증성 대식세포로 재프로그래밍을 유도하고 표면에 표지된 인터루킨-2 로 T 세포를 자극하여 암 미세환경을 개선하고자 하였다.

표면에 인터루킨-2 가 표지 된 염증성 대식세포 유래 세포밖소포체(M1EV-IL2)를 얻기 위한 첫번째 방법으로, 유전자 조작을 하기 위해 렌티바이러스 기반 형질도입 방법을 이용해 감염된 세포로부터 방출되는 세포밖소포체 표면에 인터루킨-2 가 표지 되도록 유도하였다. 두번째 방법은 화학반응을 기반으로 한 방법으로, N3 와 DBCO 간의 생물학적 직교 클릭 화학반응을 이용하였다. DBCO-IL2 는 EDC/NHS 반응으로 제작되었고, M1EV 표면에 N₃ 를 표지하기 위해서 두가지 방법을 이용하였다. 먼저 글라이칸을 세포에 처리하여 조작된 세포로부터 유래된 세포밖소포체 표면에도 N3 가 표지 되도록 하였다. 또 다른 방법으로는 M1EV 표면에 DSPE-PEG-N3 가 끼어 들어가도록 유도하여 EV 표면에 N3 가 표지 되도록 하였다. M1EV 가 불순물 단백질과 구분되어 분리되었으며, 변형 방법에 관계없이 변형 전 후 EV 의 크기나 분산도 값의 유의한 변화를 일으키지 않았다. EV 의 특성에 변화를 끼치지 않고 EV 의 변형이 진행되었음을 의미한다.

종양 관련 대식세포(M2)의 염증성 대식세포(M1)로의 M1EV 의 재프로그래밍 효과를 확인하기 위해 종양 관련 대식세포(M2)에 M1EV 및 M1EV-IL2를 처리하였다. 종양 관련 대식세포(M2)에 M1EV 및 M1EV-IL2 를 처리하였을 때, M1 마커(IL-1β, CXCL10)가 증가하였고 M2 마커(CD206)가 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 일반적인 염증성 대식세포와 비슷한 수준까지 변화한 것을 확인하였다. 따라서 M1EV-IL2 가 암 미세환경에서 우세한 종양 관련 대식세포(M2)가 종양을 억제할 수 있는 기능이 있는 염증성 대식세포(M1)로 재프로그래밍하여 암 미세환경을 개선할 가능성일 보유하고 있음을 의미한다.

또한 M1EV-IL2 가 면역활성화와 관련된 도움(CD4+) T 세포의 활성화를 유도할 수 있는 지 시그니처 사이토카인인 IL-2 및 IFN-γ mRNA 의 상대적 발현을 확인하였다. M1EV-IL2 를 처리하였을 때, IL-2 및 IFN-γ mRNA 발현이 대조군에 비해 상대적으로 증가되었다. 도움(CD4+) T 세포뿐만 아니라 세포독성(CD8+) T 세포의 활성화를 유도하는 것 역시 암 면역치료에서 중요하다. 따라서 비장에서 naïve CD8+ T 세포를 분리하여 M1EV-IL2 를 평가하였다. M1EV-IL2 를 같이 처리하였을 때 대조군에 비해 CD8+ T 세포의 세포증식을 촉진하였고, 활성화 마커의 mRNA 발현이 상대적으로 증가하였다. mRNA 발현의 증가와 더불어 실질적으로 방출된 IFN-γ 의 양 역시 증가하였다. 이는 M1EV 표면에 표지된 IL-2 의 기능으로써 CD8+ T 세포의 세포증식 촉진과 활성화를 유도할 수 있음을 의미한다.

M1EV 의 종양 관련 대식세포(M2)로부터 염증성 대식세포(M1)로의 재프로그래밍 기능에 추가적으로 표면에 IL-2 를 표지함으로 인해 T 세포의 활성화를 유도할 수 있었다. 이처럼 세포밖소포체를 추가적으로 조작하여 치료적 잠재력 및 면역치료 효능을 더욱 향상시킬 수 있었으며 면역치료제로서 적용 가능성을 확인하였다.

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