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Title Page

Contents

Abstract 11

Ⅰ. INTRODUCTION 13

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 18

1. Bacterial strains and culture conditions 18

2. Creation of Pseudomonas aeruginosa lysogen 18

3. Preparation of phage lysate 19

4. Phage Infection Assay 19

5. PCR of phage DNA replication 19

6. qPCR for phage DNA standard curve 20

7. Transposon mutagenesis 20

8. Creation of the ligD deletion mutant 21

9. Sequence analysis 21

Ⅲ. RESULTS 25

1. Temperate phages display limited infectivity, with the imprint of the infected host strain 25

2. The limited phage infectivity correlates with the phage genome synthesis in the infected strains 28

3. Plaque formation efficiency varies by phage-producing strains 31

4. Two mutant lysogens were identified to produce progeny phages with altered limited infectivity 33

5. Altered limited infectivity of the progeny phages is associated with the phage genome, not with the host genome 36

6. Two mutant lysogens affect the limited infectivity of phages. 41

7. The whole genome sequencing of the progeny phages revealed codon changes in ORF13, ORF27 and 8 structural proteins 43

Ⅳ. DISCUSSION 48

Ⅴ. CONCLUSION 50

REFERENCES 51

ABSTRACT IN KOREAN 55

List of Tables

Table 1. Bacterial strains in this study. 22

Table 2. Primers used in this study 23

Table 3. Summary of transposon insertion site. 35

Table 4. Summary of MP29* mutation location. 45

List of Figures

Fig. 1. Identification of differential infectivity of P. aeruginosa phage MP29 from four strains. 26

Fig. 2. Identification of differential infectivity of P. aeruginosa phage PP7 from four strains. 27

Fig. 3. Verification of correlation with the DNA synthesis of the infecting MP29 phage in PCR. 29

Fig. 4. Schematic representation of limited infectivity . 30

Fig. 5. Standard curve and Fraction of infectious virion of MP29. 32

Fig. 6. Schematic representation of transposon mutagenesis and phenotype of MP29PAK mutants.[이미지참조] 34

Fig. 7. Altered differential infectivity of MP29PAK mutants.[이미지참조] 38

Fig. 8. Assessment into the altered limited infectivity of MP29*. 39

Fig. 9. DNA synthesis and fraction of infectious virions of MP29*. 40

Fig. 10. Altered differential infectivity of MP22, and DMS3 by transposants. 42

Fig. 11. Verification of mutation location in MP29*. 44

초록보기

 파지는 같은 종의 제한된 수의 박테리아 균주를 감염시킨다. 파지 감염성의 이러한 균주 특이성은 파지 엔지니어링 및 치료 적용에 대한 주요 장애물 중 하나일 수 있다. 이 연구에서 나는 녹농균에 감염할 수 있는 온대성 파지 MP29가 차등 감염성을 나타내는 것을 관찰했는데, 이는 파지를 생성하는 4가지 균주(PA14, PAO1, PAK 및 PMM49)의 라이소젠과 관련이 있다. 이 균주 특이적 또는 제한된 파지 감염성은 각 균주에서 감염 파지의 DNA 합성과 관련이 있으며, 이는 결정인자가 파지 게놈 진입 후 및 파지 입자 조립 전에 작용할 수 있음을 시사한다. Real-Time PCR(qPCR) 분석을 기반으로 각 균주에서 생성되는 파지 입자 수를 정량화하고 각 균주의 플라크 형성 단위(pfu)를 결정하여 각 파지 샘플의 균주 의존성 플라크 형성 효율을 측정했다. 흥미롭게도 PAK 균주는 PAK에서 생산된 MP29에만 감염되었으며, 다른 균주에서 생산된 MP29 파지에 대한 허용성이 가장 낮았다. MP29에 대한 PAK 라이소젠을 사용한 트랜스포존 돌연변이 유발 동안, 두 개의 돌연변이 라이소젠이 확인되었으며, 이는 MP29* 게놈에 기인하지만 돌연변이 박테리아 게놈이 아닌 변경된 제한된 감염성을 갖는 파지 (MP29*)를 생성한다. 특히, MP29*의 제한된 감염성은 앞서 언급한 4가지 균주에서 MP29의 감염성과 달랐다: PAO1, PAK 및 PMM49에서 파생된 MP29*는 PAK에서 효과적으로 플라크를 형성했지만, PA14에서는 pfu가 상당히 감소했다. MP29*의 유전자를 시퀀싱한 결과, MP29와 총 334개의 뉴클레오타이드 변화 중 52개의 코돈 차이를 보이며, 그 중 ORF13 및 ORF27의에서 7개 코돈 변화가 나타났다. 그 외의 45개의 코돈 변화는 파지 구조 단백질에서 발견 되었다.

이러한 파지 단백질의 추정되는 기능은 파지-박테리아 상호작용 동안 제한된 감염성 뿐만 아니라 파지 게놈 합성에서의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

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