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논문명/저자명
Regulation of trafficking and processing of β-amyloid precursor protein by O-GlcNAcylation / Yoon Sun Chun
발행사항
서울 : 성균관대학교 대학원, 2015.2
청구기호
TD 612 -15-22
형태사항
105 p. ; 30 cm
자료실
전자자료
제어번호
KDMT1201529467
주기사항
학위논문(박사) -- 성균관대학교 대학원, Dept. of Medicine Major of Physiology, 2015.2. 지도교수: Sungkwon Chung
원문
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Title Page

Contents

Aβbreviations 8

I. Aβstract 9

II. Background 11

1. Alzheimer's disease and Aβ production 11

1-1. APP and Aβ accumulation 11

1-2. APP processing 12

2. Cellular trafficking of APP 15

2-1. APP trafficking through the secretory pathway 15

2-2. Endocytic APP sorting and Aβ production 16

3. Maturation of APP 18

3-1. O-glycosylation of APP 18

3-2. O-GlcNAcylation and AD pathology 20

3-3. Regulation of APP trafficking by its post-translational modification 21

4. Specific Aims 23

4-1. The role of O-GlcNAcylation of APP in its trafficking and processing. 23

4-2. Regulation of APP trafficking and processing by O-GlcNAcylation at Thr 576. 24

III. Materials and Methods 25

Cell culture and experimental treatments 25

Preparation of primary hippocampal neuron 25

Point mutation and Transfection 26

Immunoprecipitation 26

Protein extraction and Western blotting 27

Cell surface biotinylation 27

Trafficking rate of APP 28

Internalization assay 28

Primary antibody uptake 29

Immunocytochemistry 30

sAPPα, sAPPβ, Aβ assay 31

Statistical analysis 31

IV. Results 32

Chapter 1. O-GlcNAcylation decreases Aβ production via reducing the endocytosis of APP. 32

1-1. PUGNAc increases O-GlcNAcylation of APP. 32

1.2. O-GlcNAcylation regulates APP processing and Aβ generation. 33

1.3. O-GlcNAcylation increases the level of cell surface APP. 34

1.4. O-GlcNAcylation of APP increases its trafficking rate from TGN to plasma membrane. 36

1.5. O-GlcNAcylation of APP regulates its endocytosis rate. 37

1.6. PUGNAc do not change endocytosis rate of transferrin 39

1.7. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents the effect of PUGNAc on Aβ secretion. 40

1.8. PUGNAc decreases the endocytosis rate of APPwt and Aβ40 production in APPwt transfected CHO cells. 42

1.9. The effects of PUGNAc on APPwt endocytosis rate and Aβ40 production were not observed in YFP-APPwt HeLa cells. 44

1.10. Thiamet-G decreased Aβ42 production and the endocytosis rate of APP. 45

1.11. The endocytosis rate of nicastrin was not changed by PUGNAc. 46

Chapter 2. O-GlcNAcylation of APP at Threonine 576 regulates its trafficking and processing. 69

2.1. APP is modified by O-GlcNAcylation at Thr 291, Thr 292, and Thr 576. 69

2.2. The mutant of APP T576A decreases its cell surface level. 70

2.3. APP T576A mutant inhibits its trafficking from TGN to plasma membrane. 71

2.4. The mutant of APP T576A was accumulated in the early endosomes. 73

2.5. The mutant of APP T576A increases Aβ40 secretion. 74

V. Discussion 87

1. O-GlcNAcylation decreases endocytosis of APP promoting non-amyloidogenic processing. 87

2. O-GlcNAcylation of APP at Threonine 576 modulates its trafficking and Aβ production. 90

VI. Conclusion 95

VII. References 97

VIII. Summary in Korea 112

Fig. 1. PUGNAc increased O-GlcNAcylated APP. 49

Fig. 2. The specificity of the O-GlcNAc antibody was blocked by Glc NAc competition. 50

Fig. 3. PUGNAc decreased the level of secreted Aβ. 51

Fig. 4. PUGNAc increased the level of cell surface APP. 53

Fig. 5. PUGNAc did not change the expression levels of secretases. 54

Fig. 6. PUGNAc increased the trafficking rate of APP from TGN to plasma membrane. 55

Fig. 7. PUGNAc decreased the endocytosis rate of APP. 57

Fig. 8. The internalized APP by PUGNAc was localized to the early endosomes. 58

Fig. 9. PUGNAc did not change the endocytosis rate of transferrin. 60

Fig. 10. The effects of PUGNAc on Aβ42 and Aβ40 productions were prevented by dynasore. 61

Fig. 11. The effects of PUGNAc on Aβ42 and Aβ40 productions were prevented by chlorpromazine. 62

Fig. 12. PUGNAc decreased the endocytosis rate of APPwt and Aβ40 production in APPwt transfected CHO cells. 63

Fig. 13. The effects of PUGNAc on endocytosis rate of APPwt and Aβ40 production were not observed in YFP-APPwt HeLa cells. 65

Fig. 14. Thiamet-G decreased Aβ42 production and the endocytosis rate of APP. 67

Fig. 15. PUGNAc did not change the endocytosis rate of nicastrin. 68

Fig. 16. Schematic illustration of APP. 76

Fig. 17. Thr 291, Thr 292, and Thr 576 residues of APP were modified by O-GlcNAcylation. 78

Fig. 18. T576A mutant resulted in the decrease of APP at the cell surface. 80

Fig. 19. T576A mutant prevents its trafficking from TGN to the plasma membrane. 82

Fig. 20. T576A mutant resulted in the accumulation in the early endosomes. 84

Fig. 21. T576A mutant traffics to the early endosomes in primary hippocampal neuron. 85

Fig. 22. Mutation of T576A resulted in the increase of Aβ40 level. 86

Fig. 23. The current model of our study. 94

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 Amyloid-β precursor protein (APP)는 소포체에서 합성되어, 골지를 통해 세포막으로 이동하며, 이 과정중에 단백질의 번역 후 변형 (N-글리코실화, O-글리코실화, 인산화, 황산화)이 이루어진다. 세포막에서 APP의 일부는 α-secretase에 의해 가수분해되어 sAPPα와 C83가 형성되고, C83은 γ-secretase에 의해 AICD와 p3가 생성되면서 Aβ는 생성되지 않는다. 이 과정을 비아밀로이드 생성경로라고 한다. 반면에, 일부의 APP는 세포막에서 clathrin-dependent endocytosis 과정을 거쳐 엔도솜에 도달하고, 이곳에서 β-secretase에 의해 가수분해되어 sAPPβ와 C99가 형성되며, C99는 γ- secretase에 의해 가수분해되어 Aβ가 생성된다. 이 과정을 아밀로이드 생성경로라고 한다. O-GlcNAcylation은 O-글리코실화의 새로운 형태이며, serine과 threonine 잔기에 monosaccharide β-N-acetylglucosamine (GlcNAc)이 결합한다. O-GlcNAc은 OGlcNAc transferase (OGT)에 의해 단백질에 결합되며, O-GlcNAcase (OGN)에 의해 제거된다. OGN의 억제제인 PUGNAc으로 O-GlcNAcylation을 증가시켰을 때, 비아밀로이드 생성경로에 의한 APP의 가수분해가 증가하여 sAPPα의 분비는 증가하고 Aβ의 분비는 감소하였다는 내용이 보고되었다. 본 연구에서, O-GlcNAcylation에 의한 APP 가수분해에 대한 분자적 작용 기전을 확인하였다. APP의 O-GlcNAcylation을 증가시키기 위해 OGN의 억제제인 PUGNAc을 처리하였을 때, sAPPα의 분비가 증가하였으며, sAPPβ와 Aβ의 분비는 감소하였다. 또한 PUGNAc은 후기골지망으로부터 세포막으로의 APP의 이동을 증가하였으며, 선택적으로 APP의 endocytosis을 감소하였고, 이로 인해 세포막에 APP가 증가되었다. Clathrin-dependent endocytosis의 억제제을 처리하였을 때, Aβ 생성에 대한 PUGNAc의 효과가 억제되었므로, PUGNAc에 의한 Aβ 분비 조절이 APP의 endocytosis을 감소에 의한 것임을 확인하였다.

APP에 존재하는 O-글리코실화가 되는 잔기는 3 곳으로 APP695를 기준으로 threonine 291, 292, 576이라고 보고되었다. 그러므로, 이 3 곳의 잔기에 O-GlcNAcylation되는지 확인하고, APP의 이동경로와 가수분해에 미치는 영향을 확인하였다. 3 곳의 threonine 잔기를 alanine으로 치환하였을 때 (T291A, T292A, T576A), APP의 O-GlcNAcylation이 전부 감소하였다. 하지만, 3개의 돌연변이 중에 T576A만 세포막에서 APP가 감소되는 것을 확인하였다. 또한 T576A 돌연변이는 후기골지망으로부터 세포막으로의 이동이 감소되었으며, early endosome에 축적되어 Aβ40의 분비가 증가되었다. PUGNAc을 처리하였을 때, 세포막에서의 APP 증가, 후기골지망으로부터 세포막으로의 APP의 이동 증가와 Aβ40 분비의 감소을 야기하는 PUGNAc의 효과가 T576A 돌연변이에서 관찰되지 않았다. 이와 같은 결과는 APP의 threonine 576 잔기에 O-GlcNAcylation이 APP의 이동경로와 가수분해를 조절하고 있음을 보여준다. 그러므로, APP의 O-GlcNAcylation이 알츠하이머병 치료에 기여할 것으로 기대된다.

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