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Title Page
Contents
INTRODUCTION 8
MATERIALS AND METHODS 11
1. Ethical statement 11
2. Chemicals and Media 11
3. Preparation and Treatment of the spermatozoa with CK-636 12
4. Isolation of G-actin (Triton-soluble Cytoskeleton) and F-actin (Triton-insoluble Cytoskeleton) in spermatozoa 12
5. Computer assisted sperm analysis (CASA) 13
6. Combined Hoechst 33258/Chlortetracycline Fluorescence Assessment of Capacitation Status 14
7. Measurement of intracellular calcium ion concentration ([Ca2+]i)(이미지참조) 15
8. Western blot analysis of tyrosine phosphorylation of sperm proteins 15
9. In vitro fertilization (IVF) 16
10. Statistical analysis 17
RESULTS 18
1. Effect of CK-636 on Actin polymerization in spermatozoa 18
2. Effect of CK-636 on sperm motility and motion kinematics 20
3. Effect of CK-636 on capacitation status 22
4. Effect of CK-636 on level of [Ca2+]i.(이미지참조) 24
5. Effect of CK-636 on protein tyrosine phosphorylation 26
6. Effect of CK-636 on fertilization and embryonic development 28
DISCUSSION 31
REFERENCES 36
국문초록 49
ABSTRACT 51
Table 1. Effect of CK-636 on sperm motility and motion kinematics. 21
Figure 1. Effect of CK-636 on actin polymerization. 19
Figure 2. Effects of CK-636 on capacitation status. 23
Figure 3. Effects of CK-636 on [Ca2+]i.(이미지참조) 25
Figure 4. Effect of CK-636 on protein tyrosine phosphorylation. 27
Figure 5. Effect of CK-636 on fertilization and embryo development. 29
Figure 6. Effect of inhibition of Arp2/3 complex on embryo development. 30
초록보기 더보기
액틴관련 단백질 2/3 복합체는 액틴 중합반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 정자에서 액틴 중합반응은 정자의 수정능획득 기간동안에 일어나며, 이는 정자의 운동성에도 중요한 역할을 하는 것으로 보고 되어있으나, 액틴관련 단백질 2/3 복합체의 역할은 아직 명확하게 보고 된 바가 없다. 이러한 이유로 본 연구에선 정자의 운동성과 운동역학변수, 수정능획득 여부 등의 다양한 정자의 기능과 정상적인 난자와의 수정 후 배발달과정에서 액틴관련 단백질 2/3 복합체의 역할을 알아보고자 하였다.
액틴관련 단백질 2/3 복합체의 기능을 확인하기 위해 억제제인 CK-636을 10, 100, 500 μM의 농도로 처리하였고 Computer assisted semen analyzer (CASA)를 이용한 정자의 운동성과 운동역학 변수의 측정, (CTC)를 이용한 수정능 획득 역부를 확인, 세포내 칼슘농도의 확인, Western blotting을 이용한 tyrosine phosphorylation을 측정 하였다. 또한 최종적으로 정상적인 난자와의 수정 후 배발달과정에서의 영향은 IVF를 이용하여 확인하였다.
CK-636의 처리는 정자의 운동역학변수 중의 Hyperactivation을 유의적으로 증가 시켰다. CTC에서는 첨체막반응이 유의적으로 증가하였으며, 세포내 칼슘 농도는 유의적으로 감소하였다. 반면에 Tyrosine phosphorylation은 유의적으로 감소하였다. 게다가 높은 농도의 CK-636이 처리된 정자는 정상적인 난자와의 수정과 배반포형성율을 유의적으로 억제 시켰다. 그러나 흥미롭게도 100 μM 농도의 CK-636의 처리는 난자와의 수정율을 증가시켜 주었지만, 배반포형성은 억제되는 결과를 확인하였다.
본 연구결과, 정자에서 액틴관련 단백질 2/3 복합체는 정자의 기능과 난자와의 수정 그리고 배발달에 중요한 역할을 하며, 나아가 이 복합체는 남성의 수정능력 진단과 피임제를 위한 마커로서 충분히 가치가 있는 단백질로 판단된다.
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