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Contents
Abstract 11
1. Introduction 14
2. Materials and method 17
2.1. Materials 17
2.1. Animals and Pharmacokinetic studies 19
2.2. Screening of reversible inhibitory effects of BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2, and S-Rh2 on cytochrome P450 activities 20
2.3. Time-dependent inhibitory effects of BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2, and S-Rh2 on nine cytochrome P450 activities using IC50 shift assay.(이미지참조) 21
2.4. Cell Line and Culture Conditions. 22
2.5. Transport Studies. 23
2.6. Measurement of TEER. 24
2.7. Preparation of standards and Sample preparation 25
2.8. LC-MS/MS conditions. 26
2.8.1. LC-MS/MS analysis of the metabolites of nine probe CYP substrates 26
2.8.2. LC-MS/MS analysis when conducting transporter studies 29
2.9. Data Analysis. 30
3. Results and discussion 32
3.1.1. Screening of reversible inhibitory effects of BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2, and S-Rh2 on cytochrome P450 activities 32
3.1.2. Time-dependent inhibitory effects of BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2, and S-Rh2 on nine cytochrome P450 activities using IC50 shift assay.(이미지참조) 39
3.1.3. Transport experiments with hMDR1-MDCKII cells 42
3.1.4. Transport experiments with hBCRP-MDCKII cells 44
3.1.5. Effects of BST204 on the pharmacokinetics of cyclosporine A in rats 46
4. DISCUSSION 48
5. References 51
국문초록 57
Table 1. Substrates, their metabolites, and their LC-MS/MS conditions of the reaction using cocktail assays. 27
Table 2. Instrument method for the LC-MS/MS analysis of loperamide, prazosin, vinblastine and chlorpropamide (IS). 30
Table 3. IC50s of BST204, R-Rg3 form, S-Rg3 form, R-Rh2 form, and S-Rh2 form on 9 CYP isozymes activities in pooled human liver microsomes(이미지참조) 33
Figure 1. Chemical structures of R-Rg3(A), S-Rg3(B), R-Rh2(C), and S-Rh2(D) 18
Figure 2. LC-MS/MS chromatograms for metabolites of nine CYPs specific substrate and their internal standard. 28
Figure 3. Inhibitory effects of BST204 extract on 9 CYP isoforms in pooled human liver microsomes. The activity of each isoform was measured using respective specific probe substrate reaction.... 34
Figure 4. Inhibitory effects of R-Rg3 on 9 CYP isoforms in pooled human liver microsomes. The activity of each isoform was measured using respective specific probe substrate reaction.... 35
Figure 5. Inhibitory effects of S-Rg3 extract on 9 CYP isoforms in pooled human liver microsomes. The activity of each isoform was measured using respective specific probe substrate reaction.... 36
Figure 6. Inhibitory effects of R-Rh2 extract on 9 CYP isoforms in pooled human liver microsomes. The activity of each isoform was measured using respective specific probe substrate reaction.... 37
Figure 7. Inhibitory effects of S-Rh2 extract on 9 CYP isoforms in pooled human liver microsomes. The activity of each isoform was measured using respective specific probe substrate reaction.... 38
Figure 8. (a)~(i). Time-dependent inhibitory effects of BST204 on 9 CYP isoforms in pooled human liver microsomes. The activity of each isoform was measured using respective specific probe substrate... 40
Figure 9. Bi-directional transport of vinblastine across Pgp-MDCKII cells in absence and presence of P-gp inhibitor cyclosporin A. Test Compound BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2 and S-Rh2.... 43
Figure 10. Bi-directional transport of loperamide across Pgp-MDCKII cells in absence and presence of P-gp inhibitor cyclosporin A. Test Compound BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2 and S-Rh2.... 44
Figure 11. Bi-directional transport of prazosin across BCRP-MDCKII cells in absence and presence of BCRP inhibitor Ko143. Test Compound BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2 and S-Rh2.... 45
Figure 12. Blood concentration-time profiles of cyclosporine A after oral administration of cyclosporine A at a dose of 30 mg/kg to rats following multiple oral administration of BST204 at doses of 0.5... 47
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발효 인삼 추출물인 BST204는 라세미 혼합물로 Rh2(5% 이상)와 Rg3(10% 이상)가 함유 되어 있는 반면 천연상태의 인삼에서는 Rh2는 거의 없고, Rg3는 매우 낮은 농도가 있다. 인삼의 성분을 ginsenoside-b-glucosidase와 acid hydrolysis방법 으로 20(R)-와 20(S)-ginsenoside Rg3(R-Rg3, S-Rg3)그리고 20(R)-와 20(S)-ginsenoside Rh2(R-Rh2, S-Rh2)를 풍부하게 변환 시켜주었다. BST204는 항암 치료하기 위하여 녹십자에서 개발 중인 천연물신약물질이다. BST204는 phase I 그리고 IIa 임상시험 과정을 독일에서 진행중이다. 최근 우리는 BST204를 반복 경구 투여한 mice에서 특이적으로 cyclosporin A의 혈액 중 농도가 증가하고 신장 및 pancreatic를 손상 시키는 것을 실험을 통해 알아냈다.
이 실험의 목적은 cyclosporin A 와 BST204사이의 약물상호작용의 메카니즘을 알아내는 것이다. Cyclosporin A은 생체 내 생체 밖에서 CYP3A4/5와 Pgp의 기질로 알려져 있다. 그러므로 첫 번째 실험은 인체 간 마이크로좀에서 BST204, R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2 그리고 S-Rh2 들을 midazolam를 이용하여 CYP3A4/5의 활성 실험을 하여 CYP3A4/5의 특별한 기질인지 알아내는 것이다. CYP3A4/5를 이용한 약물상호작용실험은 두 가지 이상의 기질을 사용한다. 또 다른 기질로는 nifedipine과 testosterone를 사용한다. 두 번째로 우리는 P-gp와 BCRP가 과발현 되어 있는 신장암세포를 이용하여 Cyclosporin A와 BST204가 있을 때와 없을 때의 basal-to-apical와 apical-to-basal를 측정하는 수송체 실험을 하였다. 추가로 우리는 P-gp가 과발현 되어 있는 신장암세포에서 R-Rg3, S-Rg3, R-Rh2 그리고 S-Rh2의 억제 활성을 실험하였다.
그 결과 BST204와 네 종의 진세노사이드는 CYP3A4/5의 활성을 억제하지 않았다. 인체간 마이크로좀에 BST204와 네 종의 진세노사이드를 넣고 NADPH를 넣은 후 30분 pre-incubation해도 IC50 값을 분명히 알수 없었고 이를 토대로 BST204와 네 종의 진세노사이드는 CYP3A4/5의 time-dependent inactivator가 아니다. 그러나 P-gp가 과발현 되어있는 신장암 세포에서 cysclosporin A (2 및 20μM)의 basal-to-apical쪽으로 이동을 BST204(1, 10, 및 100 ㎍/mL)가 특이적으로 억제하였다. 이 결과로 미루어 BST204는 P-gp의 강력한 억제제이다. 네 종의 진세노사이드중 S-Rh2가 P-gp의 강력한 억제제이다.
이 연구를 통해 발효인삼 BST204에 의한 cyclosporinA의 혈중농도 증가는 CYP3A4/5의 대사효소 억제가 아닌 약물수송체인 P-gp활성 억제에 기인한 것임을 증명하였다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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