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Title Page
ABSTRACT
Contents
PART I : XIAP is essential for shear stress-enhanced Tyr-576 phosphorylation of FAK 14
1. ABSTRACT 15
2. INTRODUCTION 16
3. MATERIALS AND METHODS 18
1) Cell culture 18
2) Transfection of BAECs with xiap siRNA 18
3) Drug treatment 18
4) Shear stress studies 18
5) Preparation of cell lysates 19
6) Western blotting 19
7) Cytotoxicity assay 19
8) Immunofluorescence 19
4. RESULTS 21
1) Shear stress stimulates Tyr-576 phosphorylation of FAK 21
2) XIAP knockdown inhibits shear stress-enhanced Tyr-576 23
3) Phosphorylation of Tyr-576 mediates shear stress-dependent ERK activation 25
4) XIAP is essential to maintain cytosolic FAK and allow interaction with Src kinase 27
5. DISCUSSION 29
6. REFERENCES 32
PART II : XIAP reverses various functional activities of FRNK in endothelial cells 35
1. ABSTRACT 36
2. INTRODUCTION 37
3. MATERIALS AND METHODS 39
1) Cell culture 39
2) Cloning of FAK and construction of deletion mutant genes 39
3) Transfection of BAECs with fak mutant genes 39
4) Preparation of cell lysates 39
5) Western blotting 40
6) Cell adhesion assay 40
7) Immunofluorescence 40
8) Immunoprecipitation 41
9) Co-transfection of BAECs with fak mutant genes and xiap siRNA 41
10) Shear stress studies 41
11) Cell migration 42
4. RESULTS 43
1) FRNK recruits into FAs and enhances cell adhesion 43
2) FRNK binds with XIAP 45
3) XIAP knockdown inhibits FRNK recruitment into FAs and FRNK-enhanced cell adhesion 47
4) XIAP depletion reverses an inhibitory effect of FRNK on shear stress-induced ERK activation 49
5) XIAP depletion reverses FRNK-inhibited endothelial cell migration 49
5. DISCUSSION 51
6. REFERENCES 55
PART III : Cytokeratin 1 controls vascular functions by anti-apoptosis, stabilization of cell adhesion and promotion of shear-sensing 58
1. ABSTRACT 59
2. INTRODUCTION 60
3. MATERIALS AND METHODS 63
1) Cell culture 63
2) KRS expression and purification 63
3) In vitro KRS binding assay 63
4) Immunofluorescence 64
5) Transfection of plasmid 64
6) Transfection of siRNA 65
7) Proliferation 65
8) Measurement of apoptosis 65
9) Preparation of cell lysates 66
10) Western blotting 66
11) Endothelial cell Adhesion 66
12) Immunoprecipitation 67
13) CKI expression and purification 67
14) In vitro CK1 binding assay 68
15) Shear stress studies 68
15) Adhesion of THP-1 68
4. RESULTS 69
1) CK1 is an essential surface molecule interacting with a pro-atherogenic factor, KRS. 69
2) Overexpression of CK1 has an anti-apoptotic effect in endothelial cells via PI₃K/Akt pathway 71
3) CK1 knockdown plays crucial roles in endothelial cell apoptosis 75
4) CK1 is an important factor for maintenance of normal cell shape 78
5) CK1 is involved in the interaction between actin and integrins 81
6) CK1 enhances endothelial cell adhesion to laminin via its head/central domain 83
7) CK1 knock-down cells maintain adhesion to laminin by forming actin fiber 84
8) CK1 interacts with laminin through integrin α6 87
9) CK1 plays a critical role in shear stress response of endothelial cells via its head/central domain of CK1 89
10) CK1 prevents monocytes binding to endothelial cells via NO production. 93
5. DISCUSSION 96
6. REFERENCES 102
국문초록 106
PART I : XIAP is essential for shear stress-enhanced Tyr-576 phosphorylation of FAK 12
Figure 1. Shear stress enhances phosphorylation of Tyr-576 of FAK. 22
Figure 2. XIAP knockdown blocks shear-enhanced phosphorylation of Tyr-576 of FAK. 24
Figure 3. DCA inhibits shear-enhanced phosphorylation of Tyr-576 of FAK. 26
Figure 4. XIAP is essential for the interaction between FAK and Src kinase. 28
Figure 5. Schematic diagram showing a role of XIAP in Tyr-576 phosphorylation of FAK. 31
PART II : XIAP reverses various functional activities of FRNK in endothelial cells 12
Figure 1. FRNK in FA increases endothelial cell adhesion. 44
Figure 2. XIAP interacts with FAK via FRNK domain. 46
Figure 3. XIAP knockdown blocks the FRNK-enhanced adhesion. 48
Figure 4. XIAP depletion reverses inhibitory effects of FRNK. 50
Figure 5. Schematic diagram for roles of FRNK in shear stress-stimulated ERK activation and endothelial cell migration. 54
PART III : Cytokeratin 1 controls vascular functions by anti-apoptosis, stabilization of cell adhesion and promotion of shear-sensing 12
Figure 1. KRS interacts with CK1 at endothelial cell surface. 70
Figure 2. CK1 overexpression inhibits TNFα- or resveratrol-induced apoptosis through Akt/PI₃K pathway. 74
Figure 3. CK1 knockdown decreases cell proliferation and increases TNFα- or resveratrol-induced apoptosis. 77
Figure 4. CK1 knockdown stimulates the formation of actin fiber, making endothelial cells sensitive to apoptosis. 80
Figure 5. Actin fibers formed by CK1 knockdown are colocalized with integrin α6. 82
Figure 6. CK1 plays a key role in cell adhesion to laminin-coated plate. 86
Figure 7. CK1 interacts with laminin through integrin α6. 88
Figure 8. CK1 is a possible shear-sensing receptor. 92
Figure 9. CK1 is expressed at low level in atherogenic patients, suggesting its preventive benefits against the development of atherosclerosis. 95
Figure 10. A schematic diagram indicating roles of CK1 in cell survival, cell adhesion, and shear stress response. 101
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내피층은 혈관의 내벽을 구성하는 단층구조로 항상 혈류에 노출되어 있다. 따라서 혈관내피층에는 혈류에 의한 마찰력인 전단응력(shear stress)이 발생한다. 혈액의 흐름은 혈관의 형태에 따라 달라져 곧은 혈관의 경우 혈류가 일정한 반면, 휘어지거나 갈라지는 혈관의 경우는 혈류가 불규칙하여 전단응력이 불안정하거나 매우 낮게 형성된다. 기존의 연구에서 전단응력이 크고 일정한 경우, 동맥경화의 발생이 억제되고 불규칙하거나 낮은 전단응력에 노출되는 혈관에서는 동맥경화반의 생성이 촉진되는 현상이 관찰되어, 전단응력은 중요한 동맥경화 발생 억제 인자로 간주되었다.
전단응력은 ECM과 내피세포 사이의 adhesion site와 연계된 세포 내의 특정 signal transduction pathway를 통해 ERK, Akt, eNOS 같은 여러 신호전달 분자를 활성화시킨다. 전단응력에 의해 활성화된 ERK는 angiogenesis, cell migration과 cell adhesion을 조절하고, Akt는 anti-apoptosis와 eNOS의 활성을 조절한다. 활성화 된 eNOS는 nitric oxide (NO)를 생성하고, NO는 내피세포의 중요한 vasodilator 중의 하나로 blood vessel의 relaxation, platelet aggregation 및 leukocyte binding의 조절에 관여한다.
전단응력 신호전달을 매개하는 ECM-cell adhesion site 중 focal adhesion site에는 focal adhesion kinase (FAK)가 존재한다. Kim et al. 의 연구에서 focal adhesion site의 FAK은 전단응력에 의하여 활성화된 후, MAP kinase pathway에 속하는 ERK를 활성화시키고, 이를 통해 cell migration을 조절하며, 이 과정에 XIAP가 필수적임을 밝혔다. 그러나 아직까지 XIAP에 대한 구체적인 기전은 밝혀지지 않았다.
본 학위논문에서는 FAK의 기능에 관여하는 XIAP의 분자기전을 보다 명쾌히 규명하고자, 다양한 실험을 수행하였다. 먼저, binding assay를 통하여 XIAP는 FRNK domain을 통해 FAK을 focal adhesion site에 결합시키고 있음을 알 수 있었다. 또한 focal adhesion site의 FAK은 전단응력에 의해 활성화된 Src와 상호작용하여 FAK의 Tyr576을 인산화시키고, ERK를 활성화하여 cell migration을 증진시키는 것을 확인하였다. 한편 XIAP가 없으면 FAK이 핵으로 이동되면서 활성화된 Src와의 상호작용이 차단되는 것을 보여 XIAP가 없을 때 ERK의 활성화가 억제되는 이유를 규명하였다. 이와 같은 연구 결과는 XIAP가 동맥경화와 밀접한 관련을 가지는 전단응력 반응에 중요한 역할을 하는 FAK의 기능에 필수적임을 보여주는 것으로 동맥경화와 같은 혈관질환 치료에 XIAP가 표적 분자가 될 수 있음을 알 수 있었다.
전단응력은 혈관질환 발생 억제에 중요한 인자이기 때문에 전단응력 sensor를 탐색하는 연구는 많이 이루어져 왔지만 자세한 분자적 기전에 대한 연구는 더 많이 수행되어야 한다. 따라서 본 학위논문에서는 앞선 연구에서 pro-atherogenic factor로 알려진 lysyl-tRNA synthetase (KRS)를 이용하여 새로운 전단응력 sensor를 발굴하였다. 그 sensor 중의 하나가 CK1으로 본 연구는 CK1의 내피세포내 기능을 분석하고자 하였다. 다양한 binding assay를 수행한 결과, CK1은 integrin a6, laminin과의 상호작용을 통해 세포와 ECM의 adhesion을 지지하는 중요 분자임을 규명하였다. 따라서 CK1을 과발현시키면 강한 전단응력 반응이 나타나 내피세포의 signal transduction pathway를 활성화시키며 NO와 같은 혈관 조절 물질의 생산도 촉진됨을 확인하였다. 전단응력에 의해 생성된 NO는 동맥경화 발생의 초기 단계인 leukocyte와 endothelial cell의 부착을 억제하여 동맥경화의 발생을 억제하는 gasotransmitter로써, CK1을 과발현시킨 세포를 전단응력에 노출시켜 증가된 NO는 leukocyte와의 부착을 억제시켰다. 또한 CK1이 과발현되었을 때, TNFa/resveratrol에 의해 유도되는 apoptosis도 억제됨을 관찰하였다. 반면 CK1의 발현을 억제하면 actin fiber가 형성되며 내피세포의 모양이 길어지는 현상을 볼 수 있었다. 이렇게 생성된 actin fiber는 integrin a6와 interaction하며 laminin에 대한 내피세포의 adhesion을 유지시키는 데 중요한 역할을 하고 있었다. 그러나 actin fiber는 전단응력 반응에는 관여하지 않고, TNFa/resveratrol에 의해 유도되는 apoptosis를 증가시키는 데 기여하였다. 한편, 내피세포의 apoptosis는 혈관벽의 permeability를 증가시키며 동맥경화의 발생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이를 근거로 CK1이 동맥경화 발생억제에 중요한 역할을 할 것이라는 가설을 설정할 수 있었으며, 동맥경화 환자의 혈관과 심장 조직에서 정상인의 것보다 CK1의 발현이 감소된 것을 통해 CK1과 동맥경화가 밀접한 관련이 있다는 것을 확신할 수 있었다. 통합하면, CK1 역시 XIAP와 마찬가지로 동맥경화 치료를 위한 target molecule로서의 가능성이 있다.
본 학위논문에서는 cardiovascular diseases를 억제시킬 수 있는 전단응력을 감지하는 CK1을 새롭게 발굴하고, 전단응력이 XIAP에 의해 전달되는 과정을 구체화하였다. 이는 내피세포가 전단응력에 반응하는 과정에 대한 기초적인 이해를 돕기 때문에 앞으로 동맥경화와 같은 cardiovascular diseases를 다각적으로 분석하고 치료할 수 있는 새로운 방법의 개발에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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