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Title Page

국문초록

Abstract

Contents

Introduction 12

Materials and Methods 22

Cells and materials 22

Cell viability assay 23

Western blot 23

Phospho-receptor tyrosine kinase (RTK) array analysis 24

Cell cycle analysis 25

Immunofluorescence 26

Soft agar assay 26

Immunodetection of incorporation of 5'-bromo-2'- deoxyuridine (BrdU) 26

Migration assay 27

Tumor xenograft study 27

Immunohistochemistry 28

Statistical analysis 29

Results 30

Synthesis of KRC-327 and its binding mode to c-Met 30

KRC-327 inhibits c-Met phosphorylation and c-Met signaling pathways 31

KRC-327 inhibits the proliferation of c-Met-dependent cancer cells 31

KRC-327 selectively inhibits the ligand dependent c-Met activity 32

KRC-327 inhibits cell proliferation through G0/G1 arrest 33

KRC-327 suppressed tumor growth in a xenograft model together with in vivo anti-proliferative effects 34

Discussion 35

Reference 40

APPENDIX 63

List of Tables

Table 1. FDA approved monoclonal antibodies 14

Table 2. FDA approved small molecular inhibitors 15

Table 3. HGF and c-Met expression in a variety of carcinomas 19

Table 4. HGF/c-Met pathway inhibitors in development 20

List of Figures

Fig. 1. Statistics of main cause of mortality in Korea from 2003 to 2010. 12

Fig. 2. Structure of c-Met 16

Fig. 3. Major down-stream signaling pathway of c-Met 18

Fig. 4. Chemical structure and docking mode of KRC-327. 46

Fig. 5. Effect of KRC-327 on the c-Met activation and its downstream signaling pathway in the MKN-45 human gastric cancer cell line. 47

Fig. 6. Effect of KRC-327 on the cell viability of human cancer cell lines with/without c-Met expression. 49

Fig. 7. Effect of KRC-327 on HGF-induced cell proliferation, anchorage-independent cancer cell growth, and cell migration. 53

Fig. 8. Effect of KRC-327 on cell cycle in MKN-45 cells. 56

Fig. 9. In vivo effect of KRC-327 in MKN-45 human gastric cancer cell-derived mouse xenograft model. 58

Fig. 10. Liver toxicity by KRC-327 treatment in plasma of MKN-45 human gastric cancer cell-derived mouse xenograft model. 62

초록보기

 c-Met은 hepatocyte growth factor (HGF)/scatter factor (SF)에 높은 친화성을 갖는 receptor tyrosine kinase (RTK)의 한 종류로, 위암, 백혈병, 흑색종, 폐암 등의 고형암에서 주로 발견되며 암의 침윤과 전이에 직접적으로 관련되어 있다고 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 최근에 개발한 새로운 c-Met 저해제인 KRC-327의 암세포에서의 효능과 그 기전을 in vitro와 in vivo에서 실험하였다.

먼저 KRC-327의 c-Met의 활성화 및 그 하위 신호전달에 미치는 영향을 확인한 결과 KRC-327은 낮은 농도부터 농도 의존적으로 c-Met의 활성도 및 하위 신호전달을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다.

또한, KRC-327은 MTS assay를 이용한 실험에서 c-Met이 과발현 된 암세포의 성장을 억제하였고, c-Met의 리간드인 HGF에 의해 암세포들이 활성화 되어 성장, 전이되는 것을 저해하는 것을 확인하였다.

KRC-327은 c-Met이 과발현 된 세포의 세포주기에도 영향을 미쳤는데, 24시간동안 KRC-327을 처리한 세포군에서 G0/G1 arrest를 통한 세포주기의 arrest를 일으켰는데 이것은 주로 Cyclin D1의 감소 및 p21과 p27 단백질의 축적을 통해서 일어나는 것으로 확인되었다. 그러나 세포사멸과 관련된 단백질, 즉 PARP, Cleaved-caspase-3는 변화가 없었는데, 이것은 KRC-327의 항암효과가 주로 세포의 증식과 분화를 억제함으로써 일어난다는 것을 의미한다.

In vivo 실험에서는 누드마우스에 c-Met이 과발현 된 사람의 위암세포인 MKN-45를 이종 이식하여 모델을 만들었으며, KRC-327을 100mg/kg씩 17일동안 매일 경구투여 하였을 때 이식된 고형암의 성장억제가 특이할 만한 독성 없이 일어났음을 알 수 있었다. 또한 암조직을 면역염색법으로 관찰하였을 때는 KRC-327을 처리한 군에서는 활성화 된 c-Met과 세포 증식과 관련된 인자들인 PCNA, p-STAT3, p-Akt, p-Mek의 발현이 감소하였다.

이 결과를 종합해 볼 때, KRC-327은 c-Met이 발현된 암 종에 대해 항암효과를 갖는데 이것은 주로 세포의 증식을 억제하는 메카니즘을 통해서 일어나며, 또한 HGF 의존적으로 일어나는 암세포의 성장과 전이를 억제하였다. 따라서 KRC-327은 c-Met을 표적으로 하는 새로운 표적치료제 로서의 가능성을 보였다.

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