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논문명/저자명
An NMR study on the structural features of intrinsically unfolded proteins = 핵자기공명 분광학을 이용한 생물학적 기능과 관련된 무정형 단백질의 구조적 특성 규명에 관한 연구 / Si-Hyung Lee 인기도
발행사항
대전 : 충남대학교 대학원, 2013.2
청구기호
TD 572 -13-19
형태사항
xiii, 131 p. ; 26 cm
자료실
전자자료
제어번호
KDMT1201311474
주기사항
학위논문(박사) -- 충남대학교 대학원, Dept. of Biochemistry, 2013.2. 지도교수: Sung-Ho Huh, Kyou-Hoon Han
원문

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Title Page

Contents

ABBREVIATIONS 7

ABSTRACT 15

PART I. OVERVIEW 17

1. Intrinsically Unfolded Proteins 17

1.1. The origin of intrinsically unfolded proteins 17

1.2. Scientific discovery of the IUP 17

1.3. What is the IUP term? 21

1.4. Functional feature of IUPs 23

1.5. Interrelation between the IUPs and various diseases. 24

1.6. The IUP in protein networks 25

1.7. The binding mechanisms 26

2. NMR spectroscopy 29

2.1. A short history of NMR 29

2.2. Theory of NMR 31

2.3. Boltzmann statistics 33

2.4. General experimental scheme 34

2.5. The HSQC pulse sequence 36

2.6. The examples of Pulse sequence for 3D NMR 38

2.7. NMR in IUPs 39

PART II. HSV VP16 TAD 41

II-1. INTRODUCTION 41

II-2. MATERIALS AND METHODS 44

1. Materials 44

2. Secondary structure prediction 44

3. PCR amplification and subcloning of VP16 TAD (412-490) 45

4. Expression and purification of VP16 TAD (412-490) 46

5. Peptide synthesis and purification 48

6. Circular dichroism (CD) spectropolarimeter 50

7. Surface plasmon resonance (SPR) 50

8. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy 51

II-3. RESULTS AND DISCUSSION 53

1. Secondary structure prediction results of VP16 TAD 53

2. PCR amplification and subcloning of VP16 TAD 56

3. Expression and purification of VP16 TAD in E. coli 57

4. CD spectra of the VP16 TAD 62

5. SPR analysis 63

6. NMR spectra of VP16 TAD 64

II-4. CONCLUSIONS 70

PART III. HBV preS1 71

III-1. INTRODUCTION 71

III-2. MATERIALS AND METHODS 74

1. Materials 74

2. Secondary structure prediction 74

3. Expression and purification of HBV preS1 (1-119) from E. coli 74

4. Peptide preparation of preS1 (21-47) 75

5. NMR spectroscopy 75

III-3. RESULTS AND DISCUSSION 76

1. Secondary structure prediction results of HBV preS1 76

2. Expression and purification of preS1 (1-119) (adr subtype) 78

3. Peptide synthesis and purification of preS1 (21-47) 81

4. NMR spectra of preS1 82

III-4. CONCLUSIONS 91

PART IV. HIF-1α ODD 92

IV-1. INTRODUCTION 92

IV-2. MATERIALS AND METHODS 94

1. Materials 94

2. Secondary structure prediction 94

3. Expression and purification of HIF-1α ODD from E. coli 94

3.1. Expression and purification of HIF-1α ODD (403-603) 94

3.2. Expression and purification of HIF1α ODD_N (404-477) 95

4. NMR spectroscopy 96

IV-3. RESULTS AND DISCUSSION 97

1. Secondary structure prediction results of HIF-1α ODD (403-603) 97

2. Expression and purification of HIF-1α ODD (403-603) 100

3. Expression and purification of HIF-1α ODD_N (404-477) 104

4. NMR spectra of HIF1α ODD 110

IV-4. CONCLUSIONS 114

PART V. DISCUSSION 115

PART VI. PERSPECTIVE 116

PART VII. REFERENCES 117

SUMMARY (IN KOREAN) 146

Table 1. Predictors of intrinsically unfolded proteins. 19

Table 2. Values for some common nuclei in NMR spectroscopy 32

Table 3. Classification of human herpes viruses. 41

Fig. 1. Growth in IUP literature 18

Fig. 2. Structural type of IUPs. 21

Fig. 3. Existing significance of the IUP in the protein network. 25

Fig. 4. Basic pulse sequence for 1D, 2D, and 3D acquision. 34

Fig. 5. General experimental scheme for 2D NMR 35

Fig. 6. Pulse sequence for the HSQC experiment. 37

Fig. 7. Pulse sequence for (A) the 3D TOCSY-HSQC and (B) the 3D NOESY-HSQC experiments. 38

Fig. 8. Functional domains of HSV VP16. 42

Fig. 9. Secondary structure prediction for VP16 TAD. 54

Fig. 10. Secondary structure prediction of VP16 TAD (412-490) using IUPred and Agadir. 55

Fig. 11. Construction of bacterial expression vectors for the production of VP16 TAD (412-490). 56

Fig. 12. Overexpression of GST-tagged VP16 TAD (412-490). 57

Fig. 13. Purification of VP16 TAD (412-490) by a Q-Sepharose column. 58

Fig. 14. Purification of VP16 TAD (412-490) by a source 15Q column. 59

Fig. 15. Gel filtration chromatography and SDS-PAGE of VP16 TAD (412 -490). 60

Fig. 16. MALDI-TOF mass spectrum of the purified VP16 TAD (412-490). 61

Fig. 17. Circular dichroism spectra of 10 μM VP16 TAD (412-490). 62

Fig. 18. Biosensorgrams of binding analysis of VP16 TAD peptide with hTAFll31.(이미지참조) 63

Fig. 19. 2D 15N-¹H HSQC spectrum of the full-length VP16 TAD (412-490).(이미지참조) 65

Fig. 20. Summary of interproton NOEs' ³JHNHd' and chemical shift index for the VP16 TAD (412-490).(이미지참조) 66

Fig. 21. Backbone dynamics of VP16 TAD. 67

Fig. 22. 2D 15N-¹H HSQC spectra and chemical shift perturbation of the VP16 TAD titrated with hTAFll31 (1-140).(이미지참조) 68

Fig. 23. Location of PreSMos and target binding sites in VP16 TAD. 69

Fig. 24. Geographic pattern of HBV infection display. 72

Fig. 25. The domain of HBV surface protein. 73

Fig. 26. Secondary structure prediction for HBV preS1 using GOR4 and Jpred3. 76

Fig. 27. Secondary structure prediction of HBV preS1 using IUPred and Agadir. 77

Fig. 28. Overexpression of GST-tagged preS1 (1-119) and GST-tagged preS1 (1-119) purified by glutathione Sepharose beads. 79

Fig. 29. Thrombin digestion of preS1 (1-119). 79

Fig. 30. Gel filtration chromatography of preS1 (1-119). 80

Fig. 31. The spectrum of preS1 (21-47) on a C18 column using RP-HPLC.(이미지참조) 81

Fig. 32. 2D 15N-¹H HSQC spectrum of the preS1 (1-119).(이미지참조) 83

Fig. 33. Summary of ³JHNHa' interproton NOEs' and chemical shift index (CSI) of Ha protons for preS1 (1-119).(이미지참조) 84

Fig. 34. Ha and Ca chemical-shift deviation and temperature coefficient of preS1 (1-119).(이미지참조) 85

Fig. 35. Plots of backbone 15N-¹H heteronuclear NOEs and 15N relaxation times against the residue number of preS1 (1-119).(이미지참조) 86

Fig. 36. Location of pre-structured regions and functional domains in preS1. 87

Fig. 37. Summary of interproton NOEs, ³JHNHa, and chemical shift index (CSI) of Ha protons for preS1 (21-47) peptide.(이미지참조) 89

Fig. 38. HBsAg secretion of HepaRG cells infected by HBV in the presence of preS1 derived peptides. 90

Fig. 39. Domains and potential functions of HIF-1α. 92

Fig. 40. Secondary structure prediction for HIF-1α ODD (403-603) using GOR4 and Jpred3. 98

Fig. 41. Secondary structure prediction of HIF-1α ODD (403-603) using IUPred and Agadir. 99

Fig. 42. Overexpression of HIF-1α ODD (403-603). 100

Fig. 43. Purification of HIF-1α ODD (403-603) by a Q-Sepharose column. 101

Fig. 44. Purification of HIF-1α ODD (403-603) by a DEAE-Sepharose column. 102

Fig. 45. Gel filtration chromatography of HIF-1α ODD (403-603). 103

Fig. 46. Overexpression of HIF-1α ODD_N (404-477). 105

Fig. 47. Purification of HIF-1α ODD_N (404-477) by a Q-Sepharose column. 106

Fig. 48. Gel filtration chromatography of HIF-1α ODD_N (404-477). 107

Fig. 49. Purification of HIF-1α ODD_N (404-477) by a DEAE-Sepharose column. 108

Fig. 50. MALDI-TOF mass spectrum of the purified HIF-1α ODD_N (404-477). 109

Fig. 51. 2D 15N-¹H HSQC spectrum of HIF-1α ODD(403-603).(이미지참조) 111

Fig. 52. 2D 15N-¹H HSQC spectrum of HIF-1α ODD_N (404-477).(이미지참조) 112

Fig. 53. The chemical shift deviations in ¹³Cα, ¹³CO, and Hα for HIF1α ODD_N (404-477).(이미지참조) 113

초록보기 더보기

 잘 정의된 구형단백질의 3차 구조가 정상적인 단백질 기능을 위해 필수적이라는 구조생물학계의 지배적인 고정관념은 2000년대 이후 생리학적 조건에서 3차 구조가 결핍된 무정형 단백질 또는 도메인들이 중요한 생물학적 기능에 관여를 한다는 보고가 기하급수적으로 증가함에 따라 구조생물학의 지배적인 고정관념에 대하여 새로운 파라다임의 변화를 예고하고 있다. 이러한 무정형 단백질들은 transcription factor, viral infection, cell signaling, membrane translocation, 및 아밀로이드 단백질 등에서 주로 발견되고, 암, 광우병, 바이러스성 질병, 파킨슨병, 그리고, 퇴행성 신경질환 등에서 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 무정형 단백질의 구조적 특징과 동력학적 정보를 얻을 수 있는 유일한 생물물리학적 방법인 핵자기공명 분광학은 자장 분광계, 다핵종, 다차원 핵자기공명 분광학 실험기법, cold probe 및 단백질의 안정한 동위 원소 표지 기법 개발 등으로 아미노산 잔기 수준에서 무정형 단백질 전체 또는 부분적인 접힘 상태를 분석할 수 있다. 본 논문에서는 무정형 단백질의 사전 구조 모티프들 (PreSMos) 의 존재와 이들의 구조-기능의 관계에 대한 증거를 예시하였다. VP16 TAD 에서는 인접하지 않은 여러 개의 사전에 형성된 구조적 모티프들이 TAF31, PC4, 및 TFIIB 같은 표적 단백질에 특이성의 결정요소로서 활동하는 부위와 중복됨을 보여 주었다. 그리고 preSI 의 경우에는 이종핵 다차원 핵자기공명 분광학의 분석으로 두 곳의 구조적 모티프를 보여주었고, 이들 구조적 모티프들이 preSI 표면 항원의 간세포 결합 영역 (잔기 21-47)으로 추정된 곳과 일치함을 보여 주였다. 마지막으로 HIF1α ODD의 chemical shift 편차에서 보여준 두 개의 α-helix를 통하여 사전 구조 모티브를 확인하였다. 이들 결과는 무정형 단백질 내의 PreSMos가 표적 단백질들과 상호작용 할 때 활성 부위로서의 기능을 하고 있음을 나타낸다.

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