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Contents
ABSTRACT 9
I. INTRODUCTION 11
II. MATERIALS AND METHODS 13
1. Cell culture and alkaline phosphatase staining 13
2. Transfection of microRNAs 14
3. Cell proliferation and viability assays 14
4. Cell death assay and flow cytometry 15
5. Real time quantitative PCR for miRNA 15
6. RT-PCR 15
7. Western blot analysis 16
8. Plasmid constructs and transfection of plasmid 17
9. Luciferase constructs and reporter assay 17
10. Zebrafish experiments 18
11. Statistical analysis 19
III. RESULTS 20
1. miR-182 is expressed in bone and MC3T3E1 preosteoblasts and its expression increases with osteoblast differentiation 20
2. Effect of miR-182 on the proliferation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells, MC3T3E1 preosteoblasts and primary calvaria cells 22
3. Effect of miR-182 on the death of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells, MC3T3E1 preosteoblasts and primary calvaria cells 24
4. Effect of miR-182 on the differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells, MC3T3E1 preosteoblasts 26
5. FoxO1 is a target of miR-182 in C3H10T1/2 mesenchymal stem cells and MC3T3E1 preosteoblasts 28
6. In vivo effect of miR-182 in bone in a zebrafish model 31
IV. DISCUSSION 33
V. CONCLUSION 38
REFERENCES 39
ABSTRACT(IN KOREAN) 43
Figure 1. miR-182 expression in tissues and during osteoblast differentiation. (A) Alkaline phosphatase (ALP) staining of MC3T3E1 preosteoblasts after transfection of five candidate microRNAs (miRNAs) with two published miRNAs.... 21
Figure 2. miR-182 inhibits cell viability. (A-B) Level of proliferation and cell numbers after transfection of miR-182. *p＜.05, **p＜.01, ***p＜.001 compared to miR-Control transfected cells.... 23
Figure 3. miR-182 promotes cell death. (A) LDH assay of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells, MC3T3E1 preosteoblasts and primary calvaria cells transfected with miR-Control or miR-182.... 25
Figure 4. miR-182 inhibits osteoblast differentiation. (A) Alkaline phosphatase activity after transfection of cells with miR-182. C3H10T1/2 mesenchymal stem cells or MC3T3E1 preosteoblasts were transfected with miR-Control or miR-182 and... 27
Figure 5. miR-182 targets the FoxO1 3'UTR. (A) Schematic of the miR-182 putative target site in the mouse FoxO1 3' untranslated region (UTR) and alignment of miR-182 with the FoxO1 3'UTR showing complementary pairing.... 30
Figure 6. Effects of miR-182 on skeletogenesis in vivo zebrafish model. (A-D) Morphological phenotype of zebrafish embryos injected with dre-miR-Control (A) or dre-miR-182 (B-D).... 32
초록보기 더보기
조절되지 못한 산화 스트레스는 노화로 인해 나타나는 질환들의 대표 병인으로 알려져 있다. 대표적인 노화 관련 골대사 질환인 골다공증에 있어서도 증가된 산화 스트레스가 중요 병인의 하나로 작용한다는 것이 세포나 인간을 대상으로 한 연구를 통해 알려졌다. 산화 스트레스에 대한 방어책으로 각 세포에는 항산화 역할을 하는 단백질이 존재하는데 그 중 대표적인 것이 FoxO 단백질이다. FoxO1, 3a, 4의 세가지 중, FoxO1이 골대사에 있어서는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 FoxO1을 과발현시킨 경우, 조골세포주들의 증식과 분화를 촉진시키고 사멸을 억제하는 것으로 나타났다. 그러나 아직까지 뼈에서 항산화 역할을 하는 것으로 알려진 FoxO1을 조절하는 인자들에 대해서는 거의 알려진 바가 없었다. 한편 microRNA는 22-23개의 nucleotide로 이루어진 비번역 RNA로서 최근 몇 몇 연구들을 통해 microRNA가 골대사에 관여하는 중요한 전사인자들을 조절함으로써 조골세포의 분화와 골형성에 중요한 역할을 담당하고 있음이 보고되었다. 본 실험에서는 Silico analysis와 문헌고찰을 통하여 FoxO1을 억제함으로써 조골세포의 증식 및 분화를 억제하고, 사멸을 촉진하여 최종적으로 골형성을 저해하는 microRNA인 miR-182를 도출하였다. 조골세포주에 miR-182를 과발현시킨 결과, 조골세포의 증식이 감소하고 사멸이 증가하였고, 분화가 억제되었으며 zebrafish를 통해 확인한 in vivo 실험에서도 miR-182의 과발현은 골형성을 현저히 저하시키는 것을 확인할 수 있었다. 이후 생물 정보학 검색 및 확인 실험을 통해 FoxO1이 miR-182의 표적 단백질임을 확인하였고, FoxO1을 과발현 시킨 경우, miR-182에 의한 세포 증식 및 분화 억제와, 사멸의 증가가 회복됨을 관찰할 수 있었다. 이상의 실험 결과들을 통해 miR-182가 FoxO1을 억제함으로써 조골세포증식과 사멸, 그리고 분화에 중요한 부정적인 영향을 주는 조절 인자임을 확인 할 수 있었다. 따라서 miR-182를 조절함으로써 FoxO1의 발현을 증가시키는 것이 대표적인 노화질환의 하나인 골다공증의 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
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