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Title Page

Abstract

Contents

I. Introduction 9

II. Materials and Methods 11

1. Preparations of recombinant CCDC110 protein 11

2. Cell culture 11

3. Production of monoclonal antibodies 11

4. siRNA transfection 12

5. Real time PCR and quantitative RT-PCR 12

6. SDS-PAGE and Immunoblotting 13

7. Immunofluorescence staining and confocal microscopy 14

III. Results 15

1. Initial characterization of CCDC110 monoclonal antibodies (Isotyping and immunoblotting) 15

2. Immunoprecipitation of CCDC110 with monoclonal antibodies 15

3. siRNA mediated Knockdown of CCDC110 16

4. EGFP tagged CCDC110 can be detected by Immunoflouroescence staining 17

5. Detection of centrosomal localizing CCDC110 17

6. Immunofluorescence staining of pEGFP and pCIneo-CCDC110 cotransfected cell 18

IV. Discussion 32

References 34

국문초록 37

List of Tables

Table 1. Summary and Iso-typing of CCDC110 monoclonal antibody 30

Table 2. Sequence list of synthetic siRNA used in this experiment 31

List of Figures

Fig. 1. Microarray data of expression of CCDC110 proteins in regenerating liver 19

Fig. 2. Microarray data of expression of CCDC110 proteins in EGR1 overexpressed cell line 20

Fig. 3. The expression of CCDC110 increases along with spermatogenesis 21

Fig. 4. Characterization of CCDC110 monoclonal antibodies 22

Fig. 5. Immunoprecipitation and Immunoblotting of CCDC110 with monoclonal antibodies 23

Fig. 6. siRNA mediated knockdown of CCDC110 24

Fig. 7. Overexpressed CCDC110 (EGFP tagged CCDC110) can be detected by Immunofluorescence staining 25

Fig. 8. Most of the antibodies can detect the centrosomal CCDC110 26

Fig. 9. IF staining of CCDC110 protein with diluted ascites from mouse 27

Fig. 10. Cotransfection of EGFP and overexpression of CCDC110 28

Fig. 11. CCDC110 protein expression in testis, as detected by antibody CCDC110 29

초록보기

 KM-HN-1(CCDC110)은 C-terminal coiled-coil domain을 갖는 단백질로서 이전 연구에서 사람의 암/정소 특이 단백질(cancer/testis antigen)로 확인되었다. CCDC110은 testis와 stomach, tougue, melanoma, colon을 포함한 다양한 cancer안에서 mRNA의 level이 현저하게 증가한다. C-terminal coiled-coil region이외에도 CCDC110은 단백질을 핵으로 위치 지우는 NLS와 두 단백질간에 이합체를 만들 수 있는 leucine zipper motif를 포함한다. 지금까지 이 protein의 역할은 밝혀지지 않았으며 이용할 수 있는 단세포군 항체 또한 아직 입증되지 않았다. Microarray dataset의 몇몇 자료는 CCDC110이 cell proliferation과 관련이 되어있다고 보여진다. 우리는 면역블롯팅 분석을 통해 CCDC110에 대한 단세포군항체의 확립을 입증했다. 우선 재조합된 N-terminal GST fusion protein은 purify했고 immunize mouse에 대한 항원으로 사용하였다. 마우스에서 얻어진 비장세포를 Myeloma cell로 융합하고 ELISA screening을 통하여, CCDC110 단백질에 반응하는 사용할 수 있는 총 아홉 가지의 clone들을 얻었다. 우리는 clone들의 isotype을 결정하였고, 나아가 각 clone들을 이용하여 적합한 항체를 알아내어 면역블롯팅과 면역침전법, 면역형광염색법등을 이용하여 각각의 CCDC110 항체의 기능과 한계를 확인하였다. 이 연구에서 얻어진 단클론 항체들은 이후의 CCDC110 의 생물학적인 역할을 구명하는데 유용한 도구로서 사용될 수 있을 것이다.

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