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표제지
국문요약
목차
1. 서론 9
2. 실험재료 및 방법 12
2-1. Plasmids and Adenovirus preparations. 12
2-1-1. hTERTrib-TK-mir122aT cloning 12
2-1-2. Pri-122a cloning 13
2-1-3. Adenoviral vector 제작 13
2-1-4. Tetracycline regulated gene expression vector cloning 14
2-2. Phenol extraction & ethanol precipitation 14
2-3. Maintenance of cell lines 15
2-4. Tetracycline regulated miR-122a stable cell line 제작 15
2-5. DNA Transfection 16
2-5-1. Ex-gen 500 을 사용한 DNA transfection 16
2-5-2. LT-1 을 사용한 DNA transfection 16
2-5-3. Trans IT-TKO 를 사용한 RNA transfection 16
2-6. RNA isolation and real-time PCR 16
2-7. Northern blot assay 17
2-8. RT-PCR 을 통한 trans-splicing products 를 확인 18
2-9. Suicide gene activity assays 를 통한 miR-122a regulation 을 확인 18
2-10. MTT assay 에 의한 cell survival rate determination 19
2-11. In vivo toxicity studies 19
3. 결과 20
3-1. miR-122a regulated ribozyme design 20
3-2. In vitro 에서 hTERT-TK-miR122aT ribozyme 의 특이성 확인 20
3-2-1. Tans-splicing products 확인 20
3-2-2. Ribozyme RNA transcript level 로 miR122a regulation 확인 21
3-2-3. hTERT targeting ribozyme-miR122aT 을 발현하는 adenovirus에 의해 간암 세포 특이적 세포사 유도 검증 및 miR-122a 에 의한 선택적 세포사 유도검증 22
3-3. Tetracycline 에 의해 조절되는 miR-122a 발현 stable cell제작 23
3-4. Animal model 에서 hTERT targeting ribozyme-miR122T virus 의 toxicity 여부 관찰 23
4. 고찰 39
5. List of Figures and Table. 42
Abstract 43
참고문헌 45
Figure 1. Schematic diagram of the modified trans-splicing ribozyme. 25
Figure 2. Expression of transgene using miRNA target site. 26
Figure 3. Structure of the plasmids used to package replication competent hTERTrib-TK-miR-T viruses. 27
Figure 4. Target hTERT RNA-dependent induction of transgene expression by specific trans-splicing ribozyme. 29
Figure 5. miR-122a inhibits TK expression at mRNA level by targeting the 3' UTR in the hTERTrib-TK-miR-T. 31
Figure 6. Efficacy and specificity of TS ribozyme. Target hTERT RNA-dependent induction of TK expression by specific trans-splicing ribozyme. 33
Figure 7. Tetracycline regulated miR-122a expression. 35
Figure 8. Elevation in serum ALT, AST levels and liver tissue H&E staining in mice after injection of Ad-PEPCK-hTERTrib-TK-122a. 37
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