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ABSTRACTS

Contents

Abbreviations 17

Introduction 19

1. CD40 and its ligand CD154 20

2. Expression of CD40 on different cell types 20

3. Functions of CD40 in B lymphocytes 21

3-1. Antigen (Ag) presentation 21

3-2. Ig isotype switching 23

3-3. B cell activation and selection 23

3-4. Development of germinal centers and humoral memory 24

4. Mouse B cell development 24

4-1. Initiation of B lymphopoiesis in the BM 24

4-2. Pogression to mature functional B cell populations 27

5. Human B cell development 27

6. The goals of the thesis 31

CHAPTER I. CD40-induced ROS production by either NAPDH oxidase or 5-LO in B cell 32

A. Introduction 33

B. Materials & methods 41

1. Abs and reagents 41

2. Plasmids 42

3. Cell culture and transient transfection 42

4. Isolation of primary human and mouse B cells 43

5. Western blotting and Immunoprecipitation 44

6. Fluorescence measurement of intracellular ROS 45

7. Immunofluorescence by confocal microscopy 45

8. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 46

C. Results 47

1. CD40 iduces the ROS generation and p38 MAPK activation in human PBLs 47

2. P85, a regulatory subunit of PI3-K associates directly with CD40 and 5-LO 50

3. P85 mediates the CD40 signal to 5-LO by direct association with CD40 and 5-LO 53

4. Both NADPH oxidase and 5-LO pathways are involved in the CD40-mediated ROS production in activated mouse splenic B cells 55

D. Discussion 59

CHAPTER II. Characterization of phenotypically distinct B cell subsets and CD40-stimulated MAPK activation in human umbilical cord blood 64

A. Introduction 65

B. Materials & methods 69

1. Abs and Reagents 69

2. Mononuclear cells purification and B cell enrichment 69

3. Cell stimulation and MAPK activation 70

4. Flow cytometic analysis 70

5. RT-PCR 71

6. Western blot analysis 72

7. Intracellular phosphospecific flow cytometry 73

C. Results 74

1. Defective responses to CD40 ligation in CB MNCs 74

2. Expression of molecules that are involved in the CD40-mediated signaling events in CB B cells 74

3. Phenotypic characterization of CB B cell subsets 79

4. CD40-mediated MAPK activation in the B cell subsets of CB 83

5. MAPK activation followed by the stimulation with BCR or CD40 in different B cell subset of adult PB 85

D. Discussion 91

CHAPTER III. CD40-induced p190RhoGEF expression and differentiation of B cells to Ab-secreting plasma cells 94

A. Introduction 95

B. Materials & methods 106

1. Constructs 106

2. Cell culture and isolation of splenic B cells 106

3. Transfection and Retrovial Infection 107

4. RNA extraction and RT-PCR 108

5. Western blotting 109

6. Flow cytometry in mouse B cell lines 109

7. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 110

8. RT-PCR analysis for the isotype switching 111

9. Generation of transgenic mice 111

10. Genomic DNA isolation and PCR 112

11. Imnunization 112

12. Flow cytometry in the study of Tg mice 113

C. Results 114

1. Induced expression of p190RhoGEF after CD40 stimulation 114

2. Induction of p190RhoGEF after surface IgM and CD40 stimulation 114

3. Level of p190RhoGEF expression in immature and mature B cells 117

4. P190RhoGEF expression and B cell maturation into plasma cells 119

5. Requirement of the p190RhoGEF function through RhoA activity in B cell maturation 125

6. Requirement of p190RoGEF function through RhoA activity in the induction of Blimp-1 or XBP-1 127

7. Induction of p190RhoGEF expression drives B cell differentiation into Ig secreting plasma cells. 130

8. Generation of p190RhoGEF transgenic mice 134

9. Peripheral B cell development in both WT and DN p190RhoGEF-Tg mice 134

10. TD responses in both WT and DN p190RhoGEF Tg mice 136

11. Memory responses in both WT and DN p190RhoGEF Tg mice. 142

D. Discussion 149

Conclusion 156

REFERENCES 161

국문초록 174

감사의 글 178

Table 1. Phenotypes of peripheral B cell subsets 28

Table 2. ROS as second messengers 35

Figure 1. Biological effects of CD40 activation on different stage of B cell development. 22

Figure 2. Stages in mouse B cell development in the BM. 26

Figure 3. Antigen-independent development of B cells. 29

Figure 4. Stages of human B cell development in the BM. 30

Figure 5. Signaling pathway coupled to CD40-CD40L interaction. 34

Figure 6. Structure and activation of the NADPH oxidase. 37

Figure 7. Signaling pathways for the ROS production after ligation of TNFR superfamily members. 39

Figure 8. ROS production and p38 MAPK activation in human PB B cells. 48

Figure 9. P85 directly interacts with both CD40 and 5-LO. 51

Figure 10. 5-LO and p85 are recruited to the CD40 receptor complex after CD40 ligation in Raji human B cells. 54

Figure 11. 5-LO induction and ROS production after CD40 ligation in the activated mouse splenic B cells. 57

Figure 12. Model for the CD40-induced ROS signaling in human B cells. 63

Figure 13. The receptor-mediated MAPK activation in MNCs isolated from CB. 75

Figure 14. Phosphorylation of ERK by receptor activation in CB, BM, and PB MNCs. 76

Figure 15. Phosphorylation of p38 MAPK by receptor activation in CB, BM, and PB MNCs. 77

Figure 16. CD40+ B cell population in MNCs isolated from CB, BM and PB.(이미지참조) 78

Figure 17. Inefficient signal transduction followig CD40 stimulation in CB B cells but not PB B cells. 80

Figure 18. Expression of signaling molecules in human B cells isolated from BM, CB, and PB. 81

Figure 19. Characterization of B cell population in CB, BM, and PB MNCs. 82

Figure 20. Human transitional B cells from different sources. 84

Figure 21. ERK activation in the B cell subsets of CB. 86

Figure 22. Phosphorylation of p38 MAPK in the B cell subsets of CB. 87

Figure 23. ERK activation following the ligation of BCR and CD40 in the different B cell subsets of PB. 89

Figure 24. Phosphorylation of p38 MAPK in the different B cell subsets of PB following the ligation of BCR and CD40. 90

Figure 25. The Rho GTPase switch. 97

Figure 26. Schematic representation of the p190RhoGEF protein and closely related Dbl family members. 99

Figure 27. Antigen-dependent B cell development (GC reaction). 101

Figure 28. Enhanced expression of p190RhoGEF and cellular changes by CD40 stimulation in WEHI 231 and mouse splenic B cells. 115

Figure 29. Induction of p190RhoGEF after BCR and/or CD40 stimulation. 118

Figure 30. Comparison of the p190RhoGEF expression among B cells in different maturation stages. 120

Figure 31. Correlation between enhanced expression of p190RhoGEF and the expression of syndecan-1 or CXCR4. 122

Figure 32. Correlation of p190RhoGEF expression and transcription factor induction for B cell maturation. 123

Figure 33. Generation of stable cell lines by retroviral infection. 126

Figure 34. Effects of the p190RhoGEF overexpression and RhoA activity on the induction of syndecan-1 and CXCR4. 128

Figure 35. The p190RhoGEF-RhoA function is required for the induction of syndecan-1 and CXCR4. 129

Figure 36. Expression regulation of various transcription factors by p190RhoGEF-RhoA function. 131

Figure 37. Effects of p190RhoGEF-RhoA function on the antibody secretion and isotype switching. 132

Figure 38. Construct of p190RhoGEF transgene and its expression. 135

Figure 39. Development of splenic B cells in the p190RhoGEF Tg mice. 137

Figure 40. GC formation at day 7 after immunization with NP-KLH in the p190RhoGEF Tg mice. 138

Figure 41. Plasma cell differentiation in the p190RhoGEF Tg mice. 140

Figure 42. Antibody production in the response to TD antigen in vivo and following in vitro activation. 141

Figure 43. Isotype switching and transcription factor regulation in the p190RhoGEF Tg mice. 143

Figure 44. Memory responses in the p190RhoGEF Tg mice. 144

Figure 45. Antibody responses after secondary immunization in the p190RhoGEF Tg mice. 147

Figure 46. Model for p190RhoGEF-RhoA function in Post GC B cell development. 155

CD40는 TNFR계에 속하는 세포 표면 단백질로서 CD40에 의한 신호전달은 생체 면역반응에 중요한 역할을 담당한다. 특히, CD40를 통한 신호는 B 임파구에서 궁극적으로 전사 인자를 조절하여 세포의 활성화, 성숙화 및 분화 과정에 기여한다. 그러나 이러한 중요성에도 불구하고 CD40에 의한 B 임파구의 고유기능이 조절되는 명확한 기전은 아직 밝혀져 있지 않은 상태이다. 본 논문은 B 임파구의 활성화 및 분화를 유도하는 CD40를 통한 신호를 크게 세부분으로 나누어 연구하였다.

첫번째 연구는 CD40 수용체에 의한 활성 산소종의 생성기전에 관한 내용이다. 이전의 연구 결과는 CD40 자극에 의해 WEHI 231 B 임파구 세포주에서는 NADPH oxidase 경로를 통해, Raji B 임파구 세포주에서는 5-LO 경로를 통하여 각각 활성산소종이 생성되고, PI3-K 단백질의 활성이 두가지 경로에 모두 관련되고 있음을 밝혔다. 또한 이러한 활성 산소종이 CD40에 의한 p38 MAPK 활성화에 second messenger로서의 역할을 담당하고 있음을 밝혔다. 본 연구에서는 CD40 자극에 의한 활성 산소종의 생성과 이로 인한 p38 MAPK 활성화를 사람의 말초 혈액에서 얻어낸 B 임파구 (PBLs) 안에서 검사하였다. 그 결과, 세포주에서의 실험 결과와는 달리 NADPH oxidase와 5-LO에 의한 두가지 경로 모두가 CD40 자극에 의한 활성 산소종의 생성과 이로 인한 p38 MAPK 활성화 과정에 관여하고 있음을 알게 되었다. 또한 이러한 결과는 활성화된 마우스의 B 임파구에서도 관찰되었다. 즉, 마우스 B 임파구가 활성화되면 5-LO 단백질의 발현이 크게 증가할 뿐 아니라, CD40에 의한 활성 산소종의 생성에도 NADPH oxidase와 5-LO에 의한 경로 모두가 관여될 수 있음을 제시하고 있다. 또한, 단백질들의 상호 작용에 관한 연구를 통해 PI3-K의 regulatory subunit인 p85가 CD40 및 5-LO단백질과 직접 결합함으로써 CD40 자극에 의한 활성 산소종 생성을 위한 signaling complex 형성을 매개한다는 사실을 발견하였다.

두번째 연구는 사람의 제대혈 B 임파구에서 CD40 자극에 의해 유도되는 신호전달에 관한 내용이다. 골수 이식과 비교해 볼 때, 제대혈 이식 후 B 임파구의 기능이 느리게 회복되며 특히, 다양한 종류의 면역 글로불린(Ig)이 생산되지 않는다고 보고된 바 있다. CD40 수용체에 의한 신호전달이 Ig isotype switching에 중요하기 때문에 본 실험에서는 제대혈 B 임파구들의 CD40 신호전달이 비정상적일 가능성을 예측하고 이를 시험하였다. 즉, 제대혈, 골수, 그리고 말초 혈액에서 각각 추출한 B 임파구내에서 세포 표면 수용체에 의한 MAPK 활성화를 비교하였다. 그 결과, 제대혈 내의 B 임파구 subest들은 BCR에 의한 MAPK 활성화는 정상적으로 일어나지만, CD40에 의해서는 상당히 손상되어 있음을 발견하였다. 본 연구에서는 이러한 손상된 신호전달의 원인을 규명하고자 여러가지 가능성들을 시험하였다. 그 결과, CD40에 의한 신호전달에 관련된 단백질들의 발현은 세가지 source의 B 임파구에서 비슷하게 나타났지만, flow cytometry 결과로부터 memory B 임파구와 transitional B 임파구의 특정 subset이 제대혈 내에 거의 존재하지 않음을 발견하였다. CD40 자극에 의한 MAPK 활성화가 주로 이러한 특정 subset들에서 강하게 유도되기 때문에, 이들 특정 B 임파구 subset들의 상대적인 결여가 제대혈 B 임파구에서 정상적인 CD40 반응이 일어나지 못하는 이유를 설명할 수 있으리라 예상된다.

세번째 연구는 CD40 자극에 의해 유도되는 p190RhoGEF 단백질의 기능을 통해 B 임파구의 활성화, 성숙화 및 분화 과정의 신호전달이 조절될 수 있다는 내용이다. 이전의 연구에서 RhoA를 특이적으로 활성화하는 p190RhoGEF가 CD40 자극에 의해 그 발현이 증가하는 단백질들 중의 하나로 발견되었으며, 또한 p190RhoGEF 혹은 CA 형태의 RhoA 단백질이 과발현 되었을 때, CD40 자극이 없어도 B 임파구의 활성화가 유도될 수 있음을 보고한 바 있다. 본 연구에서는 이러한 결과들을 통해 p190RhoGEF 단백질이 CD40를 통한 B 임파구의 성숙화 과정에 관여될 수 있음을 예측한 후, 성숙화 단계가 다른 B 임파구들에서의 p190RhoGEF의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 성숙화된 B 임파구에서 p190RhoGEF 단백질의 발현이 증가되어 있으며, 이러한 발현 양상은 항체를 생산하는 세포에서 많이 발현되는 syndecan-1과 같은 세포 표면 단백질과 Blimp-1과 같은 전사 인자들의 발현 양상과 일치한다는 사실을 발견하였다. 또한, 이러한 표면 단백질 및 전사 인자들은 미성숙 B 임파구에서는 CD40 수용체가 활성화될 때 그 발현이 유도되었지만, p190RhoGEF WT 또는 CA 형태의 RhoA 단백질을 과발현시킨 세포주에서는 CD40에 의한 활성화 없이도 그 발현 정도가 성숙한 B 임파구에서와 유사하게 증가되어 있었다. 뿐만 아니라, 이러한 단백질 과발현 세포주들에서 IgM 또는 IgG 항체의 분비 역시 증가되어 있음을 발견하였다. 이러한 결과들을 통해 p190RhoGEF 단백질이 B 임파구가 항체 생산 세포로 분화하는 과정에 관련되어 있음을 예측할 수 있었다. 본 실험에서는 또한 WT과 DN 형태의 p190RhoGEF 형질전환 마우스에서의 B 임파구 subset 비교, T 임파구 의존적 항원 반응 등의 분석을 통해, p190RhoGEF 단백질이 CD40 자극에 의해 유도되는 GC B 임파구 형성부터 항체 생산 세포로의 분화 및 면역기억 세포로의 분화 과정에도 관여할 수 있음을 확인하였다.