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논문명/저자명
Ethylbenzene과 Xylene의 제거 능을 가진 P. putida E41과 BJ10의 분리 및 특성에 관한 연구 / 김란희
발행사항
수원 : 경기대학교 대학원, 2008.2
청구기호
TM 579 -8-30
형태사항
xii, 100 p. ; 26 cm
자료실
서고(열람신청 후 1층 논문실)
제어번호
KDMT1200804637
주기사항
학위논문(석사) -- 경기대학교 대학원, 미생물학, 2008.2
원문

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표제지

목차

Ethylbenzene과 Xylene 제거능을 가진 P. putida E41과 BJ10의 분리 및 특성에 관한 연구 16

제1장 서론 16

제1절 이론적 배경 18

1. BTEX 구성 성분의 특성 18

2. BTEX의 유해성 20

3. BTEX의 생물학적 분해 22

I. Ethylbenzene 제거 능을 가진 Pseudomonas putida E41의 분리 및 특성에 관한 연구 40

제1장 논문개요 40

제2장 재료 및 방법 41

제1절 균주 분리 41

1. 시료 채취 41

2. 균주 증식배양 및 분리 41

제2절 고효율 분해 균주 선별 및 동정 43

1. 스크린 테스트 43

2. 고효율 분해 균주 동정 44

제3절 Ethylbenzene 분해 특성 조사 46

1. 최적 배양 조건 확립 46

2. 회분식 실험 47

3. 분리한 균주의 건조중량 (Dry cell weight: DCW)과 흡광도 (Optical density: O.D)와의 상관관계 도출 47

제4절 시료의 분석 48

1. 검량선 작성 48

2. 액상 내 물질농도 계산 49

3. 분해특성 분석 50

제3장 결과 및 고찰 51

제1절 균주 분리 51

제2절 고효율 분해 균주 선별 및 동정 51

1. 스크린 테스트 51

2. 고효율 균주 동정 56

제3절 고효율 분해 균주 성장 특성 관찰 60

1. 최적 분해 조건 확립 60

2. 회분식 실험 65

제4장 부록 73

1. Standard curve of ethylbenzene 73

2. Optical density (OD) vs Dry cell weight (DCW) 74

II. Xylene 제거 능을 가진 P. putida BJ10의 분리 및 특성에 관한 연구 75

제1장 논문개요 75

제2장 재료 및 방법 76

제1절 증식배양 및 균주 분리 76

1. 토양샘플과 증식배양 76

제2절 고효율 분해 균주의 분리 및 동정 76

1. 스크린 테스트 76

2. Benzene, toluene, 그리고 ethylbenzene의 고효율 분해 균주를 이용한 스크린 테스트 77

3. 고효율 균주 동정 77

제3절 회분식 실험 77

1. 최적 배양조건 확립 및 회분식 실험 77

2. 단일균주 (BJ10)에 의한 o-, m-, p-xylene의 제거 78

3. 단일균주 (BJ10) 및 혼합균주 (BJ10, E41)에 의한 BTEoX의 분해 78

4. 생물학적 처리시스템에서의 BTEX 제거 78

제4절 측정 및 분석 79

제3장 결과 및 고찰 80

제1절 균주 분리 및 고효율 분해 균주 선별 80

1. 균주 분리 및 스크린 테스트를 통한 o-xylene 제거 고효율 균주 선별 80

2. 고효율 균주 동정 81

제2절 회분식 실험 84

1. 최적배양조건 확립 84

2. 회분식 실험 89

3. 단일균주에 의한 o-, m-, p-xylene의 제거 90

4. 단일 균주들 (P. putida BJ10, E41)과 혼합균주에 의한 BTEoX의 제거 92

5. 생물학적 처리시스템에서의 BTEX 제거 96

참고문헌 98

ABSTRACT 112

Ethylbenzene과 Xylene 제거능을 가진 P. putida E41과 BJ10의 분리 및 특성에 관한 연구 10

Table 1. Physical characteristics of BTEX compound 18

Table 2. Summary of the previous reported data related to ethylbenzene biodegradation 29

Table 3. Summary of the previous reported data related to xylene isomers biodegradation 36

I. Ethylbenzene 제거 능을 가진 Pseudomonas putida E41의 분리 및 특성에 관한 연구 10

Table 1. Composition of mineral salts medium(MSM) 42

Table 2. Biodegradation of ethylbenzene during screen test with 14 strains in 6 h 52

Table 3. Biochemical and physiological characteristics of strains E6, E41 and E51 58

Table 4. Fatty acid profiles of strain E41 59

Table 5. Biodegradation of ethylbenzene in the presence of BTE mixed substrates by a mixed culture (BJ10 and E41). 72

II. Xylene 제거 능을 가진 Pseudomonas putida BJ10의 분리 및 특성에 관한연구 11

Table 1. Removal efficiency of o-xylene degrading bacteria. 81

Table 2. Comparison of physiological characteristics of BJ10 and E41 82

Table 3. Comparison of fatty acid profiles between strain BJ10 and E41 83

Table 4. BTEX degradation by Mixed culture (BJ10 and E41) 97

Table 5. Conditions of lab scale bioreactor for BTEX degradation by mixed culture 97

Ethylbenzene과 Xylene 제거능을 가진 P. putida E41과 BJ10의 분리 및 특성에 관한 연구 12

Fig. 1. Benzene metabolism by microorganisms 23

Fig. 2. The biodegradation pathway of toluene 25

Fig. 3. Pathway of anaerobic toluene degradation in denitrifying bacteria 27

Fig. 4. The proposed degradation pathway of ethylbenzene by P. putida under aerobic conditions. 31

Fig. 5. Pathway of ethylbenzene by denitrifying bacterium, strain EB1 under the anaerobic condition. 33

Fig. 6. The biodegradation pathway of m-xylene. 37

Fig. 7. The biodegradation pathway of o-xylene. 38

Fig. 8. The biodegradation pathway of p-xylene. 39

I. Ethylbenzene 제거 능을 가진 Pseudomonas putida E41의 분리 및 특성에 관한 연구 12

Fig. 1. Cell growth profile of E41, E51, and E6. 53

Fig. 2. Biodegradation of ethylbenzene by E41, E51, and E6. Cell concentration 1.0 g/L (wet weight), pH 7, temperature 30℃ , ethylbenzene concentration 100 ㎎/L. 54

Fig. 3. Comparison of degradation rate and removal rate of E41, E51, and E6. 55

Fig. 4. Photograph of ethylbenzene high removal efficient bacteria by light microscope 57

Fig. 5. Sequence data of strain E41 57

Fig. 6. Degradation rate and removal rate of ethylbenzene by P. putida E41 for effects of different cell concentration. Others conditions were set by pH 7, temperature 30℃, and substrate concentration 100 ㎎/L. 61

Fig. 7. Degradation rate and removal rate of ethylbenzene by P. putida E41 for effects of pH. Others conditions were set by cell concentration 1.0 g/L (wet weight), temperature 30℃, and substrate concentration 100 ㎎/L. 62

Fig. 8. Degradation rate and removal rate of ethylbenzene by P. putida E41 for effects of temperature. Others conditions were set by cell concentration 1.0 g/L (wet weight), pH 7 and substrate concentration 100 ㎎/L. 63

Fig. 9. Degradation rate and removal rate of ethylbenzene by P. putida E41 for effects of substrate concentrations. Others conditions were set by cell concentration 1.0 g/L (wet weight), pH 7 and temperature 30℃. 64

Fig. 10. Biodegradation of ethylbenzene and cell growth by P. putida E41 at 50 ㎎/L (initial ethylbenzene concentration), pH 7 and 25℃. 66

Fig. 11. Biodegradation of ethylbenzene and cell growth by P. putida E41 at 100 ㎎/L (initial ethylbenzene concentration), pH 7 and 25℃. 67

Fig. 12. Biodegradation of benzene, toluene and ethylbenzene in a complex substrates by P. putida E41. Initial BTE concentrations 50 ㎎/L, cell concentration 1.0 g/L (wet weight), pH 7 and... 69

Fig. 13. Biodegradation of benzene, toluene and ethylbenzene in a complex substrates by P. putida BJ10. Initial BTE concentrations 50 ㎎/L, cell concentration 1.0 g/L (wet weight), pH 7 and... 70

Fig. 14. Biodegradation of benzene, toluene and ethylbenzene in a complex substrates by mixed culture, strain BJ10 and E41. Initial BTE concentrations 50 ㎎/L, cell concentration 1.0 g/L... 71

Fig. 15. Standard curve of ethylbenzene 73

Fig. 16. Correlation of optical density and dry cell weight of P. putida E41 74

II. Xylene 제거 능을 가진 Pseudomonas putida BJ10의 분리 및 특성에 관한 연구 14

Fig. 1. Photograph of lab bioreactor. 79

Fig. 2. Effect of cell concentrations on biodegradation by P. putida BJ10. Others conditions were pH 7, incubation temperature 30℃, and o-xylene concentration 10 ㎎/L. 85

Fig. 3. Effect of pH on biodegradation by P. putida BJ10. Others conditions were cell concentration 1.0 g/L(wet weight), incubation temperature 30℃, and o-xylene concentration 10 ㎎/L. 86

Fig. 4. Effect of incubation temperatures on biodegradation by P. putida BJ10. Others conditions were cell concentration 1.0 g/L(wet weight), incubation temperature 30℃, pH 7, and o-xylene concentration 10 ㎎/L. 87

Fig. 5. Effect of o-xylene concentrations on biodegradation by P. putida BJ10. Others conditions were cell concentration 1.0 g/L(wet weight), incubation pH 7, and incubation temperature 30℃. 88

Fig. 6. Biodegradation of o-xylene by P. putida BJ10. To improvement of removal efficiency, 5, 10 ㎎/L toluene was injected in contained 10 ㎎/L o-xylene in liquid medium.... 89

Fig. 7. Comparisons of o-, m- and p-xylene degradation by P. putida BJ10. Conditions were cell concentration 1.0 g/L(wet weight), pH 8, temperature 30℃, and substrate concentration 10 ㎎/L. 91

Fig. 8. Biodegradation of BTEoX by P. puitda BJ10. Others conditions were cell concentration 1.0 g/L(wet weight), pH 7, temperature 30℃ and BTEX concentration was 200 ㎎/L (each substrate concentration was 50 ㎎/L). 93

Fig. 9. Biodegradation of BTEoX by P. putida E41. Others conditions were cell concentration 1.0 g/L(wet weight), pH 7, temperature 30℃ and BTEX concentration was 200 ㎎/L (each substrate concentration was 50 ㎎/L). 94

Fig. 10. Biodegradation of BTEoX by mixed culture (BJ10+E41). Others conditions were cell concentration 1.0 g/L(wet weight)(each cell concentration was 0.5 g/L), pH 7, temperature 30℃ and BTEX concentration... 95

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인천소재의 유류오염 토양으로부터 ethylbenzene 분해 균주 14개를 분리하였다. 이 중, E41 균주는 고효율 분해 균주로 선별 되었다. 형태학적, 생리·생화학적 특징과 16S rDNA, 지방산 분석을 통해 E41 균주는 Pseudomonas putida로 동정 되었다. 최적 배양 조건은 균 농도 0.1 g/L(wet weight), pH 7, 배양온도 25℃, 그리고 ethylbenzene 농도 50 mg/L 이었다. 최적 조건 하에서 회분식 실험 결과, 분해 율은 0.17 mg/mg-DCW/hr 이었고, 비성장속도(μmax)는 0.68 h-1 이었다. 100 mg/L의 ethylbenzene 농도에서 34.1 mg/L/hr의 가장 높은 제거율을 보였다. BTE(benzene, toluene, ethylbenzene) 혼합 오염(각 각 50 mg/L 농도)에서, E41에 의한 ethylbenzene의 제거율은 6.4 mg/L/hr 이었고, BJ10과 E41의 혼합균주에 의한 ethylbenzene의 제거율은 6.9 mg/L/hr 이었다. 전체적으로, P. putida E41은 다른 균주들 보다 높은 효율로 ethylbenzene을 분해 할 수 있었고, benzene과 toluene이 첨가 되어있더라도, ethylbenzene의 효율을 높일 수 있었다.

본 연구에서는 xylene을 분해하는 순수 미생물을 분리하기 위해 인천 소재 주유소 저장창고 밑 부분의 토양에서 균주를 분리 하였으나, 제거 능을 볼 수 없었다. 그러나, Benzene, toluene을 고효율로 분해하는 strain BJ10, ethylbenzene을 고효율로 분해하는 strain E41 균주를 적용 하였을 때, 24 시간 내에 70.6, 18.7 %의 제거 능을 보였다. Strain BJ10과 E41은 형태학적 특징, 생리·생화학적 테스트, 16S rDNA 분석, 그리고 지방산 분석 결과 Pseudomonas putida로 동정 되었다. Strain BJ10의 xylene 제거 시, 최적 배양 조건은 균 농도 2.0 g/L, pH 8, 온도 20℃, o-xylene 농도 5 mg/L 이었다. 초기 o-xylene 농도 10 mg/L, 균 농도 1.0 g/L, pH 7, 20℃의 조건에서 12 h 내에 1.7 mg/L로 제거되었다. 그러나, 세포 성장은 일어나지 않았다. P. putida BJ10을 xylene 이성질체(o-, m-, p-xylene) 제거에 적용하였을 때, 24시간 내에 각 70.8, 78.3, 그리고 62.5%의 제거율을 보였다. 마지막으로, P. putida BJ10(0.1 g/L)(wet weight)과 P. putida E41(0.1 g/L)(wet weight) 혼합 균주의 BTEX 제거 실험에서 xylene은 benzene, toluene, ethylbenzene이 모두 제거 된 후 제거가 시작 되어 11시간 내에 30.4 mg/L에서 9.8 mg/L로 제거 되는 것을 확인 하였다.

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