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논문명/저자명
Pseudomonas stutzeri BM190 세포 외 P(3HB) 분해효소에 의한 PHA의 분해에서 기질 결합 도메인 Ⅰ과 Ⅱ의 역할 / 배준모
발행사항
진주 : 경상대학교 대학원, 2007.2
청구기호
TM 579 ㅂ388p
형태사항
iv, 49 p. ; 26 cm
자료실
전자자료
제어번호
KDMT1200712563
주기사항
학위논문(석사) -- 경상대학교 대학원, 응용미생물학, 2007.2
원문
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표제지

목차

Abstract 8

I. 서론 9

1. Polyhydroxyalkanoic acid(PHA) 구조적 특성 및 분포 9

2. PHA depolymerase의 생리, 생화학적 특성 10

3. 연구목적 및 연구내용 14

II. 재료 및 실험 16

1. 시약 16

2. 사용 균주 및 플라스미드 16

3. 효소적 분해 실험을 위한 PHAs granules의 세균 세포 내 축적 및 분리 정제 16

1) Nutrient broth 배지 17

2) PHA 합성 배지 17

3) PHA granules의 축적 17

4) PHAs granules의 세포로부터의 분리 17

4. P. stutzeri BM190의 세포 외 P(3HB) 분해효소 정제 18

5. P. stutzeri BM190의 chromosomal DNA 분리 18

6. phaZPst BM190(이미지참조)을 이용한 3가지 형태의 재조합 단백질 제작 및 정제 19

1) Genomic DNA library screening용 DNA probe 제조 19

2) His6 가 tagging된 PhaZPst BM190의 정제(이미지참조) 20

7. PHA 구조 결정을 위한 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance, NMR) 분광학 실험 22

8. PHA granule의 분해 후 반응산물의 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석 22

9. 재조합 세포 외 P(3HB) 분해효소에 의한 p-Nitrophenyl (PNP)-esters의 분해 22

10. PHA granules 분해의 1차 속도론적 분석 23

11. 정제 단백질의 전기영동 23

12. 단백질 정량 23

13. 기체 크로마토그래피(gas chromatography,GC)에 의한 PHA 성분 분석 23

III. 결과 및 고찰 25

1. P. stutzeri BM190 세포 외 P(3HB) 분해효소에 의한 P(3HB-co-3HV) copolymer granule 분해 연구 25

1) 효소의 특성 및 assay 조건 결정 25

2) 분리, 정제된 enzyme의 농도에 따른 여러 type의 P(3HB-co-3HV) copolymer granules 분해 및 1차 반응 속도론적 분석 27

3) HPLC / NMR을 이용한 PHA의 분해 산물 분석 31

2. P. stutzeri BM190 세포 외 P(3HB) 분해효소의 재조합 단백질 제조를 위한 probe 준비와 cloning 35

1) DNA sequence 및 추정된 amino acid sequence 분석 35

2) P. stutzeri BM190의 세포 외 P(3HB) 분해효소 유전자(phaZPst BM190)(이미지참조)의 cloning 36

3) X-ray differaction에 의한 P(3HB) granules의 결정성 분석 40

4) 재조합 세포 외 P(3HB) 분해효소에 의한 p-nitrophenyl(PNP)-esters의 hydrolysis 41

3. 분리, 정제된 enzyme의 농도에 따른 여러 type의 PHA granules 분해의 1차 반응 속도론적 분석 42

IV. 결론 47

V. 표목차 48

VI. 그림목차 49

VII. 참고문헌 51

감사의 글

Table 1. Characteristics of microbial extracellular PHA depolymerase genes. Liker region of depolymerase between the catalytic domain and substrate binding domain 12

Fig. 1. General structure of polyhydroxyalkanoic acid 9

Fig. 2. Domain structure and subclasses of bacterial polyhydroxyalkanoate (PHA) depolymerases. An interpretation of microvbial PHA depolymerases is shown (from Kingbell et al. 1996. modified) 13

Fig. 3. Cloning and overexpression of P. stutzeri extracellular P(3HB) depolymerase. (A) Extracellular P(3HB) depolymerase gene(PhaZPst BM190)(이미지참조). S. signal peptide; C. catalytic domain; L. linker region; I. substrate-binding domain I : II, substrate-binding domain II (B) PCR products and construction of expression vector, first lane primer. His-... 21

Fig. 4. Effect of PMSF on the extracellular P(3HB) depolymerase purified from P. stutzeri BM190 25

Fig. 5. (A) Temperature dependency of the extracellular P(3HB) depolymerase purified from P. stutzeri BM190. (B) pH dependency of the extracellular P(3HB) depolymerase purified from P. stutzeri BM190 26

Fig. 6. First-order kinetics analysis for the degradation of P(3HB-co-3HV) granules isolated from H. pseudoflava ATCC 33668 by the P. stutzeri BM190 extracellular P(3HB) depolymerase (0.6 ㎍/㎖). The degradation reaction was done at 50℃ 28

Fig. 7. First-order kinetics analysis for the degradation of P(3HB-co-3HV) granules isolated from W. eutropha H16 by the P. stutzeri BM190 extracellular P(3HB) depolymerase(0.6 ㎍/㎖). The degradation reaction was done at 50℃ 29

Fig. 9. Expanded 13C-NMR(이미지참조) spectra obtained before and after degradation of P(3HB-co-3HV)copolyesters isolated from H. pseudoflava ATCC 33668 by the P. stutzeri BM190 extracellular P(3HB) depolymerase(0.6 ㎍/㎖) 32

Fig. 10. Expanded 13C-NMR(이미지참조) spectra obtained before and after degradation of P(3HB-co-3HV) copolyesters isolated from W. eutropha H16 by the P. stutzeri BM190 extracellular P(3HB) depolymerase(0.6 ㎍/㎖) 33

Fig. 11. HPLC analysis of degradation products of P(3HB-co-3HV) copolyester granules by the P. stutzeri BM190 extracellular P(3HB) depolymerase (0.6㎍/㎖). (A) P(3HB-co-3HV) copolyester granules isolated from H. pseudoflava ATCC 33668. (B) P(3HB-co-3HV) copolyester granules isolated from Wautersia eutropha. The degradation reaction... 34

Fig. 12. Nucleotide sequences of the phaZPst BM190(이미지참조) gene and deduced amino acid sequence of the gene product. A putative ribosome-binding site is black box and the processing site of the depolymerase precursor is marked by a vertical arrow. A putative linker region is filled gray box, and... 37

FIG. 13. Alignment of the putative SBD of the P(3HB) depolymerase with those of other proteins. The sequences of the PHB depolymerases from PhaZPst' A. feacalis T1(PhaZAfaT1), A. feacalis AE122(PhaZAfaAE122), R. pickettii(PhaZRpi), Comamonas sp. (PhaZCsp), C. testosteroni(PhaZCte), C. acidovorans(PhaZSex), and P. lemoignei(PhaZ1Pre, PhaZ2Pre,... 38

Fig. 14. Agarose gel electrophoresis of the PCR products and restricted fragments. (A) Agarose gel electrophoresis of the PCR products. Lane M, Molecular standard (λ-Hind Ⅲ/DNA); Lane 0,Restriced pET-28a plasmid by XhoⅠ, Nde Ⅰ ; Lane1, PCR product(① region in (B) used for PCR amplification); Lane 2, PCR product(of ② in(B)); Lane 3, PCR producr(of ③... 39

Fig. 15. X-ray differaction analysis of structure of P(3HB) granule isolated from H. pseudoflava ATCC 33668. ① peak, P(3HB) granules prepared by hypochlorite treatment used in this study; ② peak, crystallized P(3HB)... 41

Fig. 16. The degradation of PNP-butyrate by the recombinant enzyme(0.6 ㎍/㎖). The degradation reaction was done at 50℃ 42

Fig. 17. Degradation of various types of P(3HB-co-3HV) granules isolated from H. pseudoflava ATCC 33668 by the recombinant extracellular P(3HB) deploymerase (0.6㎍/㎖). The degradation reaction was done at 50℃ 44

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