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Contents
ABSTRACT 8
Introduction 10
Materials and methods 16
Cell culture and virus infection. 16
Expression plasmid. 16
Construction of the truncation mutants of the 84-kDa UL112-113 proteins. 18
Construction of the UL44 truncation mutants. 19
Yeast two-hybrid assay. 20
In vitro transcription/translation. 22
Synthesis and purification of GST fusion protein. 23
In vitro binding assay (GST pull-down assay). 24
Transient DNA transfection. 24
Coimmunoprecipitaion. 25
Antibodies. 26
Indirect immunofluorescence assay (IFA). 27
Immunoblot analysis. 27
Result 29
Interaction of the UL112-113 proteins with UL44 in the yeast two-hybrid assay. 29
The UL112-113 proteins are associated with UL44, but not with cellular PCNA, in HCMV-infected cells. 32
UL44 interacts with all of the four different UL112-113 proteins in vitro. 35
Domains of the 84-kDa form required for interaction with UL44. 39
Both the C-termina1 region and the central dimerization domain of UL44 are necessary for binding with the 84-kDa UL112-113 protein. 42
Recruitment of UL44 to the pre-replication foci by UL112-113 proteins requires both coexpression of the UL112-113 proteins and UL44 binding. 48
Discussion 53
REFERENCES 58
국문초록 66
Figure 1. Interaction of the four UL112-113 proteins with UL44 (PPF) in yeast two-hybrid assays. 30
Figure 2. Interaction of the UL112-113 with UL44 or PCNA in virus-infected cells. 33
Figure 3. Interaction of the UL112-113 proteins with UL44 in vitro. 37
Figure 4. Coimmunoprecipitation of truncation mutant forms of the 84-kDa UL112-113 protein with UL44. 40
Figure 5. Construction of expression plasmid containing the 84-kDa (SD) cDNA. 43
Figure 6. Coimmunoprecipitation of the 84-kDa UL112-113 protein and the UL44 truncation mutants. 46
Figure 7. Effects of the expressing four UL112-113 proteins on the recruitment of UL44 to the pre-replication foci. 50
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인체 싸이토메갈로바이러스 게놈의 UL112-113 부분으로부터 선택적인 스플라이싱에 의해 34, 43, 50, 84-kDa의 분자량을 갖는 단백질들이 발현된다. 이들 4가지의 단백질들은 252 아미노산을 포함하는 exon-1(UL112)을 단백질의 N 말단에 공통으로 포함하고 있다. 비록 HCMV 게놈에서 UL112 혹은 UL113 부분이 효율적인 바이러스 복제에 필요하다는 유전적 연구 보고들이 있지만, 바이러스 복제에 있어서 4가지의 UL112-113 단백질들의 정확한 기능은 알려지지 않았다. 본 연구에서는 UL112-113 단백질들이 바이러스 DNA 합성효소 촉진 인자(DNA polymerase processivity, PPF)인 UL44와 상호작용하고 있음을 바이러스가 감염된 세포에서 보여주었다. 34, 43, 50-HDa 단백질들은 공통적으로 갖고 있는 N 말단의 252 아미노산을 통해 UL44와 결합하는 반면에 84-kDa 단백질은 UL44와의 효율적인 결합에 있어서 N 말단의 exon-1 부분뿐만 아니라 253에서 620의 아미노산을 필요로 하였다. UL44의 이합체형성(dimerization) 영역은 41에서 290 아미노산으로 확인되었다. 84-kDa 단백질과의 상호작용에 있어서, HL44는 중앙의 이합체형성 영역뿐만 아니라 C 말단의 290-433 아미노산을 필요로 하였다. 이 결과는 UL44의 이합체형성이 84-kDa 단백질과의 결합에 필요함을 제시해 준다. 면역형광분석법(immunofluorescence assay)에서, ULl12-113 단백질은 다른 복제 단백질 없이도 UL44를 바이러스의 복제가 일어나는 PML oncogenic domain (POD)로 재배치시킬 수 있음을 보였다. UL112-113 단백질의 이러한 능력은 UL44 결합과 관련이 있으며, 4 가지의 단백질이 모두 발현되었을 때 가장 효율적이었다. 이로부터 UL112-113 단백질은 YL44과 결합하고 YL44를 POD로 재배치시킬 수 있음을 보여준다. 또한 UL112-113의 84-kDa 단백질이 YL44와의 상호작용과 UL44의 POD로의 효율적인 분포에 있어서 독특한 역할을 할 것으로 보여진다.
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