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Title Page
Contents
ABBREVIATION 12
ABSTRACT 14
CHAPTER I. Arsenic Trioxide (As₂O₃)-Induced Apoptosis, Cell Cycle Arrest and Down Regulation of BCR-ABL in K562 Cells 17
I. INTRODUCTION 18
II. MATERIALS AND METHODS 26
Materials 26
Cell culture and in vitro cytotoxicity assay 26
Electron microscopy 27
Chromatin condensation by fluorescence microscope 28
DNA fragmentation analysis 28
Cell cycle analysis by flow cytometry 29
Preparation of cell lysates 30
Western blot analysis 30
Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 31
Data presentation 35
III. RESULTS 36
Cytotoxic effects of As₂O₃ 36
Effects of As₂O₃ on morphological changes 36
Effect on the change of chromatin condensation 41
DNA fragmentation characteristic of apoptosis 41
Activation of caspase-3 by As₂O₃ 44
Effect of caspase inhibitor on the cytotoxicity of As₂O₃ 44
Effect on cell cycle phase distribution 47
Effect of As₂O₃ on the Bcr-Abl expression 53
Effect of As₂O₃ on bcr-abl transcripts expression 55
IV. DISCUSSION 58
CHAPTER II. The Involvement of p38 MAP kinase in Apoptosis Induced by As₂O₃ in K562 Cells 65
I. INTRODUCTION 66
II. MATERIALS AND METHODS 71
Materials 71
Preparation of cell lysates and Western blot analysis 71
DNA fragmentation analysis 72
Chromatin condensation by fluorescence microscope 72
Cell cycle analysis by flow cytometry 73
Data presentation 73
III. RESULTS 74
Activation of p38 kinase and JNK 1/2 74
Inhibition of ERK 1/2 77
Activation of MEK 3/6 and ATF-2 by As₂O₃ 77
Inhibition of DNA fragmentation by SB203580 79
Inhibition of apoptotic cell death by SB203580 82
Inhibition of caspase-3 by SB203580 87
Effect of SB203580 on cell cycle 87
IV. DISCUSSION 91
CONCLUSIONS 95
REFERENCES 98
국문요약 121
Table I-1. Sequences of primers 34
Table I-2. Time-dependent alteration in cell cycle induced by As₂O₃. 50
Table II-1. Effect of SB203580 on the alteration of cell cycle by As₂O₃ in K562 cells. 90
Figure I-1. Schematic view representing metaphase chromosomes. 22
Figure I-2. Simplified scheme of the ber and abl genes with indicated breakpoints. 23
Figure I-3. Locations of primers 33
Figure I-4. Cytotoxic effects of As₂O₃ on K562 cells. 37
Figure I-5. Electron micrographs of K562 cells treated with As₂O₃. 39
Figure I-6. Fluorescence microscopic appearance of Hoechst 33258-stained nuclei of As₂O₃-treated cells. 40
Figure I-7. Apoptotic K562 cells by As₂O₃. 42
Figure I-8. Dose-dependent induction of DNA fragmentation in As₂O₃-treated K562 cells. 43
Figure I-9. Induction of DNA fragmentation in As₂O₃-treated K562 cells. 45
Figure I-10. Activation of cleaved caspase-3 by As₂O₃. 46
Figure I-11. Effect of caspase inhibitor, Z-VAD-fmk, on cytotoxicity in As₂O₃-treated K562 cells. 48
Figure I-12. FACS analysis of K562 cells treated with As₂O₃. 49
Figure I-13. Time-dependent alteration in G2/M phase induced by As₂O₃. 51
Figure I-14. Dose-dependent alteration in cell cycle induced by As₂O₃. 52
Figure I-15. Effect of As₂O₃ on p210BCR-ABL expression in K562 cells.(이미지참조) 54
Figure I-16. Detection of the bcr-abl transcripts in KS62 cells by RT-PCR. 57
Figure II-1. The Mitogen-Activated Protein (MAP) kinases in multiple signaling pathways. 68
Figure II-2. Activation of p38 kinase by As₂O₃ in K562 cells. 75
Figure II-3. Activation of JNK 1/2 by As₂O₃ in K562 cells. 76
Figure II-4. Inhibition of ERK 1/2 by As₂O₃ in K562 cells. 78
Figure II-5. Activation of MEK 3/6 by As₂O₃ in K562 cells. 80
Figure II-6. Activation of ATF-2 by As₂O₃ in KS62 cells. 81
Figure II-7. Inhibition of p38 activation by SB203580, a specific inhibitor of p38. 83
Figure II-8. Inhibition of As₂O₃-induced DNA fragmentation by SB203580. 84
Figure II-9. Effect of SB203580 on As₂O₃-induced apoptosis. 85
Figure II-10. Effect of SB203580 on cytotoxicity in As₂O₃-treated K562 cells. 86
Figure II-11. Inhibition of caspase-3 by SB203580 in As₂O₃ treated K562 cells. 88
Figure II-12. Effect of SB203580 on the alteration of G2/M phase by As₂O₃ in K562 cell. 89
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만성 골수성 백혈병 (CML)은 모든 성숙단계의 골수구계 세포의 증식과 세포유전학적으로 필라델피아 염색체를 특징적으로 나타내는 조혈모세포 질환으로 CML 세포주인 K562세포는 bcr-abl 융합유전자에 의한 tyrosine kinase의 높은 활성에 의해 발생되는 백혈병 세포이다. 여러 자극에 대해 상당히 높은 apoptosis 내성을 가지고 있어 치료에 또한 어려움이 많은 질환 중의 하나이다.
최근 arsenic trioxide (AS₂O₃)는 all-trans retinoic acid에 내성을 보이거나, 재발된 급성 전골수성 백혈병 환자의 치료에 있어서 좋은 효과를 보였음을 보고한 이래로 다른 악성 질환 및 골수 증식성 질환 등에서도 실험이 진행 중에 있다. 본 연구에서는 bcr-abl 융합유전자를 가진 K562세포를 이용하여 As₂O₃가 apoptosis에 미치는 영향과 mitogen-activated protein (MAP) kinase 와 관련된 작용기전에 대해 알아보고자 하였다.
우선 K562세포에 대한 As₂O₃의 세포 독성능에 대해 살펴 본 결과 24시간 배양시 50% 세포독성을 나타내는 IC50은 10 μM로 나타났으며, 전자현미경 및 형광현미경을 통해 핵의 분절, 염색 질 응축, apoptotic body 등 apoptosis로 진행되는 세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다. Apoptosis의 특징인 DNA 분절이 20μM의 As₂O₃처리 12시간과 24시간에서 형성됨을 1.8% agarose 전기영동을 통해 확인하였다.
또한 AS₂O₃ 처리에 의한 caspase-3의 활성 증가를 관찰하였고, caspase 억제제인 Z-VAD-fmk를 함께 처리한 경우 As₂O₃만 처리한 군에 비해 세포독성이 감소하였고 DNA 분절능이 억제된 결과를 통해 caspase-3가 apoptosis mediator로서 작용한다는 것을 확인하였으며, As₂O₃가 세포주기에 영향을 미치는지 알아보고자 시간별, 농도별로 처리하여 유세포 분석을 통해 세포주기 변화를 측정한 결과, G2/M 세포의 비율이 높게 나타남을 확인하였다. 그리고, Western blot 분석을 통해 As₂O₃에 의한 Bcr-Abl oncoprotein 발현변화를 관찰한 결과, 대조군에 비해 AS₂O₃ 처리 시 감소되었음을 확인하였고, RT-PCR에 의한 bcr-abl 융합유전자 검출에서도 대조군과 10 μM 처리군에서는 305 bp의 위치에서 band가 관찰되었으나, As₂O₃ 2μM 처리 후에는 거의 관찰되지 않음을 통해, AS₂O₃가 Bcr-Abl 단백질의 down-regulation에 관 여함을 확인하였다.
다음으로 As₂O₃에 의해 유도되는 apoptosis와 관련된 신호전달과정 중 MAP kinase와 관련하여 알아보았다. As₂O₃처리에 의한 apoptosis과정 중 p38, 그의 upstream으로 작용하는 MEK 3/6, 그리고 transcription factor인 ATF-2의 활성이 증가되었음을 Western blot 분석을 통해 확인하였다. P38의 inhibitor인 SB203580 의 전처리시 AS₂O₃로 유도되는 DNA 분절능의 억제와 apoptotic cell death가 억제됨을 확인함으로써 apoptosis와 p38 MAP kinase의 관련성을 뒷받침하였다. 그러나, SB203580 처리 후 세포 독성능과 세포주기 변화에 미치는 영향을 살펴본 결과 매우 의미있게 감소되지 않음을 보아서 AS₂O₃에 의한 apoptosis에 있어서 p38 kinase만으로는 충분하지 못하며 다른 요인이 작용할 것이라 보며 이에 대한 추후 연구가 계속되어야 될 것이다.
위의 실험 결과를 통해 K562 CML 세포주는 As₂O₃에 의해 apoptosis가 유도되었으며, 이 과정에서 caspase-3의 활성증가와 Bcr-Abl 단백질의 down-regulation 및 mRNA의 소실 등을 확인하였다. 그리고 이와 관련된 신호전달기전은 MAP kinase family 중에서 p38 kinase pathway가 관여한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 AS₂O₃에 의한 apoptosis 기전을 응용함으로써 CML에 있어서 새로운 치료제의 가능성에 관한 정보의 제공과 함께 임상적 응용에도 도움을 줄 것으로 생각된다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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