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ABSTRACT

Contents

List of Abbreviations 16

Chapter 1. General Introduction 20

1.1. Advanced Polymeric Hydrogels for Tissue Engineering and Regenerative Medicine 20

1.1.1. Trends in Tissue Engineering and Regenerative Medicine 20

1.1.2. Bioactive Polymeric Hydrogels for In Situ Tissue Regeneration 21

1.2. Understanding the Endogenous Wound Healing Process and Foreign Body Reaction 23

1.2.1. Innate Wound Healing Process 23

1.2.2. Foreign Body Reaction 27

1.3. Oxygen in Wound Healing 29

1.4. Hyperoxic Oxygen and Its Biological Mechanism 32

1.5. Recent Trends in Developing Oxygen-delivering Hydrogels 35

1.5.1. Oxygen-releasing Hydrogels 36

1.5.2. Oxygen-generating Hydrogels 44

1.5.3. Strategies of Oxygen-delivering Hydrogels for Wound Healing 55

1.6. Current Limitations and Requirements for Advances in Developing Oxygen-delivering Hydrogels 63

1.6.1. Cytotoxicity and Complexity of Current Techniques 63

1.6.2. Therapeutic Strategies of Recent ODGs for Tissue Regeneration 63

1.7. Overall Objectives 64

Chapter 2. Self Cross-linkable Oxygen-generating Biosealant to Immobilize Stem Cell Spheroid-laden 3D Patch for Myocardial Infarction Treatment 66

2.1. Introduction 66

2.2. Experimental Section 70

2.2.1. Materials 70

2.2.2. Synthesis and Characterization of Biosealant Polymers 70

2.2.3. Fabrication of Tissue Adhesive Biosealant 72

2.2.4. Rheological Analysis of Biosealant 72

2.2.5. Tissue Adhesive Test of Biosealant 73

2.2.6. Cytocompatibility of Biosealant 73

2.2.7. In Vivo Biodegradability and Tissue Compatibility of Biosealant 74

2.2.8. Fabrication of S_3DP 75

2.2.9. Characterization of Spheroid Morphology 75

2.2.10. Quantitative Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction 77

2.2.11. Protein Analysis using a Western Blot Analysis 77

2.2.12. Angiogenesis Analysis 79

2.2.13. Acute Rat MI Models and Transplantation of S_3DP In Vivo 79

2.2.14. Echocardiographic Evaluation 81

2.2.15. Histological Analysis 81

2.2.16. Statistical Analysis 82

2.3. Results and Discussion 83

2.3.1. Fabrication and Characterization of Tissue Adhesive Biosealant 83

2.3.2. Controllable Oxygen Generation of Biosealant 87

2.3.3. Biocompatible and Biodegradable Biosealant 89

2.3.4. Fabrication of S_3DP with Dual Pockets 91

2.3.5. Angiogenic Paracrine Effect of S_3DP 94

2.3.6. Therapeutic Effects of S_3DP on Cardiac Infarction 96

2.3.7. Reduced Cardiac Fibrosis of S_3DP on Cardiac Infarction 98

2.4. Conclusion 101

Chapter 3. Catalase-immobilized Oxygen-supplying Syringe to Fabricate Hyperoxia-inducible Hydrogels for In Situ Tissue Regeneration 102

3.1. Introduction 102

3.2. Experimental Section 106

3.2.1. Materials 106

3.2.2. Oxyringe Fabrication 106

3.2.3. Characterization of the PDA-modified syringe 107

3.2.4. Catalase Activity of Oxyringe 107

3.2.5. Oxygen-generating Kinetics of Oxyringe 111

3.2.6. Synthesis and Characterization of GtnSH and GelMA 111

3.2.7. Hydrogel Fabrication and Its Phase Transition 112

3.2.8. Oxygen-releasing Kinetics of Hydrogels In Vivo 113

3.2.9. Rheological Analysis of Hydrogels 115

3.2.10. H₂O₂ Measurements of Oxyringe and Oxygen-releasing Hydrogel 115

3.2.11. Cytocompatibility Test of Hyperoxia-inducible Hydrogels 116

3.2.12. In Vivo Hemostatic Ability Test 116

3.2.13. Subcutaneous Implantation In Vivo 117

3.2.14. In Vivo Wound Remodeling Evaluation 117

3.2.15. Histological Analysis 118

3.2.16. Statistical Analysis 118

3.3. Results and Discussion 119

3.3.1. PDA-Conjugated Syringe to Immobilize Catalase in an Oxyringe 119

3.3.2. Oxyringe Fabrication and Its Controllable Oxygen Generation 122

3.3.3. Fabrication and Characterizations of Oxygen-releasing Hydrogels 125

3.3.4. Cytocompatible Oxygen-releasing Matrices by H₂O₂ Scavenging 129

3.3.5. Hyperoxia-inducible Hydrogel as a Hemostatic Physical Barrier 133

3.3.6. Boosted Inflammation and Proliferation Phases with Hyperoxia-inducible Hydrogels 135

3.3.7. Promoted Wound Remodeling Phase via Hyperoxic Condition 139

3.4. Conclusion 141

Chapter 4. Applicability of Oxygen-supplying Technique for Fabricating Various Oxygen-delivering Platforms 142

4.1. Introduction 142

4.2. Experimental Section 144

4.2.1. Materials 144

4.2.2. Oxygener Fabrication 145

4.2.3. Characterization of the PDA-coated Container 145

4.2.4. H₂O₂-scavenging Ability of Oxygener 145

4.2.5. Synthesis and Characterization of GtnSH and GtnMI 147

4.2.6. Oxygen-generating and -supplying Capacity of Oxygener In Vitro 148

4.2.7. Fabrication of Cytocompatible Oxygen-enriched Media 148

4.2.8. In Vivo Wound Healing Evaluation and Biocompatibility Test 149

4.2.9. Total mRNA Sequencing 150

4.2.10. Histological Analysis 150

4.2.11. Statistical analysis 151

4.3. Results and Discussion 152

4.3.1. Fabrication of Oxygener via Improved PDA Coating Efficiency 152

4.3.2. Promoted H₂O₂ Scavenging and Oxygen Generation of Oxygener 155

4.3.3. Cytocompatible Oxygen-enriched Media as Hyperoxic Cell Culture Conditions 158

4.3.4. Fabrication of Hyperoxic Oxygen-releasing Hydrogels 160

4.3.5. Facilitated Wound Healing via Hyperoxic Oxidative Stress 162

4.3.6. Rapid Transition of Inflammation Phase into Proliferation Phase 164

4.3.7. Expedited Wound Remodeling Phase 167

4.4. Conclusion 170

Chapter 5. Significance and Future Perspective 171

5.1. Novelty of Our Systems 171

5.2. Future Direction 172

References 174

국문초록 209

Table 1.1. Summary of oxygen tension in various tissues and physiological conditions 34

Table 1.2. Characterization and application of various ODGs 56

Table 1.3. Summary of recent ODGs for TERM 58

Table 2.1. Sample codes and experimental condition of S_3DP. 76

Table 2.2. Sequences for primers used in qRT-PCR. 78

Table 2.3. Sample codes and compositions in animal study. 80

Table 3.1. Condition of catalase immobilization in Oxyringe. 108

Table 3.2. Sample codes and compositions of PDA-modified syringe (Final concentrations). 110

Table 3.3. Composition of hyperoxia-inducible hydrogels (final concentrations). 114

Table 4.1. Condition of catalase immobilization in Oxygener. 146

 지난 20년간 조직 공학 및 재생 의학 분야 (Tissue engineering and regenerative medicine, TERM)는 조직 손상과 장기 기능 상실에 대한 새롭고 유망한 해결책을 제시하며 크게 발전해 왔다. 이러한 발전은 주로 체외 조직 공학 (Ex vivo tissue engineering) 개발의 기초 프레임워크 역할을 하는 생체 재료의 중추적인 역할에 기인합니다. 하지만, 체외 조직 공학은 기증 조직의 질병 이환율과 세포 배양의 복잡성 등의 한계점에 직면하였다. 이러한 문제들을 바탕으로, 최근 더 유망하고 효율적인 전략으로써, in situ 조직 재생 (In situ tissue regeneration)이 떠오르고 있다. in situ 조직 재생은 생체재료의 다양한 생물·물리·화학적 자극을 통해 신체의 내재된 재생 능력과 조직 환경을 활용하는 전략이다.

조직 재생을 위한 다양한 생체재료 중에서 고분자 하이드로젤은 체내 세포외 환경과의 구조적 유사성, 조절 가능한 특성, 그리고 세포 및 치료제의 간단한 담지 능력 때문에 주목받아 왔다. 최근 조직 공학 및 재생의학의 경향에 맞춰 강성강성, 지형, 열, pH, 금속 이온 및 산소 등 다양한 생물·물리·화학적 자극을 통해 신체의 내재된 재생 능력을 활용하는 생체 활성 하이드로젤 개발이 최근 전략으로써 제시되고 있다. 다양한 자극들 중, 과산소 환경은 (21% 이상의 산소 분압), 면역세포 유입, 세포 증식, 혈관 생성, 콜라겐 성숙 등 상처 치유에 효과적인 것으로 알려져 많은 주목을 받고 있다. 따라서, 다양한 산소 전달 하이드로젤 (Oxygen-delivering hydrogel, ODG)이 산소 운반 또는 생성 물질들을 사용하여 개발되고 있으며, 유효성과 잠재성을 입증하고 있다. 하지만, 이러한 하이드로젤의 사용은 산소 전달 인자 및 그 부산물과 관련된 세포 독성 문제로 제한된다. 특히 과산화칼슘 (Calcium peroxide, CaO₂), 과산화마그네슘 (Magnesium peroxide, MgO₂), 과산화수소 (Hydrogen peroxide, H₂O₂) 등 과산화물 (Peroxide)은 쉽게 구할 수 있고, 우수한 산소 발생 능력을 보이지만, 그 부산물인 과산화수소는 고농도에서 세포 독성을 나타내는 문제가 있다. 따라서, 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 카탈레이즈의 사용이 필수적이다. 하지만, 카탈레이즈의 과도한 사용 (＞500 U/mL)은 세포 신호 전달 물질의 분해로 세포 신호 전달 기작을 억제할 수 있어, 산소 전달 인자 및 그 부산물의 세포 독성 문제를 극복하는 진보된 산소 전달 하이드로젤의 개발이 요구된다.

현재 조직 재생을 위해 개발된 산소 전달 하이드로젤 전략은 (i) 조직 손상 후 형성되는 초기 저산소증 완화, (ii) 지속적인 산소 공급을 통한 전반적인 상처 치유 과정 개선, 그리고 (iii) 과산소 산화 스트레스를 통한 체내 재생 능력 유도 세 가지로 분류된다. 모든 전략의 치료 효과는 고압 산소 치료법을 통해 입증되었으며, 대부분의 산소 전달 하이드로젤은 전략 (i) 및 (ii)를 바탕으로 설계되고 연구된다. 그러나, 현재 산소 전달 하이드로젤을 사용하여 전략 (ii)를 구현하는 것은 상처의 재구성 단계까지 충분한 산소 전달을 할 수 없어 어렵다는 문제가 있다. 따라서, 개발된 산소 전달 하이드로젤을 연구를 위해서는 정확한 전략과 치료 효과의 메커니즘이 요구된다.

따라서, 우리는 in situ 조직 재생을 위한 새로운 유형의 산소 공급 플랫폼을 개발하고, 이를 활용하여 다양한 형태의 산소 방출 하이드로젤을 제작한다. 주요 목표는 가교제, 카탈레이즈 또는 고체 과산화물로부터 생성된 금속 이온 및 과산화수소와 같은 부산물의 함유를 최소화하는 과산소 방출 하이드로젤을 개발하는 것이다. 이 전략을 통해 산소 생성 인자 및 그 부산물에 의한 세포 독성 문제를 해결할 수 있다. 또한, 우리는 과산소 산화 스트레스에 초점을 맞춰 전반적인 상처 치유 과정에 대한 이들의 안전성과 치료 효과를 입증한다. 이를 위해, 우리는 먼저 산소 방출 하이드로젤을 제조하기 위한 기본 재료로 자가 가교 하이드로젤을 처음 개발한다 (2장). 이 하이드로젤은 고분자 간의 티올-엔 반응을 통해 가교제 없이도 형성될 수 있어, 간단한 조성을 가진다. 또한, 이 가교 반응은 조직 표면의 작용기와도 상호 작용할 수 있다. 이 하이드로젤은 간단한 조성을 바탕으로 산소 방출 하이드로젤의 기본 재료로 활용하기 위해 설계되었지만, 우리는 이 하이드로젤을 허혈성 심장 표면에 심근 패치를 고정하기 위한 조직 접착성 생체 실란트로서 연구했다. 바이오 실란트의 기계적 및 조직 접착 특성을 향상하기 위해 강화제로서 과산화칼슘 (Calcium peroxide, CaO₂)을 사용하였으며, 이는 과산화수소 생성에 의해 티올화된 젤라틴의 이황화 결합 형성을 유도할 수 있어 상용 피브린 접착제보다 강력한 조직 접착력을 보인다. 이 생체적합성 바이오 실란트를 활용하여 쥐 심근 모델 내에서 심근 패치를 성공적으로 고정하였으며, 섬유화 감소와 함께 심장 기능을 개선했다.

다음으로 우리는 과산화칼슘 매개 도파민 산화 및 카탈라아제 고정화를 통해 산소 공급 주사기 (Oxygen-supplying syringe, Oxyringe (옥시린지))를 개발했다 (3장). 이 옥시린지는 고정된 카탈라아제에 의한 과산화수소 분해를 통해 산소를 생성하여 하이드로젤 용액 내에 고농도 산소를 공급하고, 활성화된 카탈라아제 혼입을 최소화한다. 우리는 이 시스템을 활용하여 주사 가능한 과산소화 유도 하이드로젤을 제작하여 생체 내에서 일시적인 과산소 환경을 제공한다. 흥미롭게도, 이러한 하이드로젤은 생체 내 지혈, 염증, 증식 및 리모델링 단계와 같은 전반적인 상처 치유 과정을 촉진한다.

카탈라아제 고정화 산소 공급 기술의 유효성을 바탕으로, 본 기술의 다양한 산소 전달 시스템 제작에 대한 적용 가능성을 연구한다 (4장). 이 기술을 튜브나 유리병과 같은 상업용 용기에 적용하고, 고정되는 카탈라아제의 농도를 높여 기능성을 향상함으로써 산소 공급 기술의 적용 가능성을 높였다. 이 산소 공급 용기 (Oxygen-supplying container, Oxygener (옥시즈너))는 기존 옥시린지 시스템 대비 3배 이상 향상된 과산화수소 분해 능력과 산소 발생 효율을 보여준다. 옥시즈너를 사용하여 잔존 과산화수소를 최소화하는 산소 담지 미디어를 제작하고, 체외 3차원 세포 배양 환경에서 세포 적합한 고농도 산소 환경을 제공한다. 다음으로, 자가 가교 하이드로젤 디스크를 간단하게 산소 담지 미디어에 담가, 미리 형성된 하이드로젤을 고농도 산소 방출 하이드로젤로 제작하였다. 이러한 산소 담지 미디어와 산소 방출 하이드로젤은 생체 내에서 일시적인 고산소 상태를 제공하여, 생체 내 대식세포 침윤, 세포 증식, 신생 혈관 형성, 섬유아세포 분화 및 콜라겐 성숙 등을 촉진한다. 특히 고농도 산소는 재구성과 관련된 유전자 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다.