본 논문은 in vivo 및 in vitro 를 통해 한국 전통건강식품인 장강환이 대장에 미치는 보호 효과를 검증하였으며, 최종적으로 장강환이 대장에서 염증 억제 효과와 그의 기전을 확인하였다. 본 논문은 3 부분 (part)으로 구성되었다.

Part 1 은 chapter 1 과 2 로 나누어져 있으며, 장강환의 성분분석과 동물체내에서의 작용에 대하여 연구를 하였다. 장강환은 대장건강식품으로서 Atractylodes macrocephala koidzumi (백출), radish leaves (무청), Viscum album var. coloratum (겨우살이), dried Zingiber officinale Roscoe (건강)성분 등 12 가지로 구성된 혼합물이다. UPLC-Q-TOF MS 분석에 의하면 장강환은 주요하게 pheophorbide A, nabumetone alcohol, dehydrocostus lactone, plantamajoside, kaempferol 3, 7-dirhamnoside, quercetin 3-D-glucuronide 및 viscumneoside III 등의 활성물질이 있는 것으로 나타났다. Chapter 1 의 실험결과 마우스 모델에서 dextran sulfate sodium (DSS)이 유도하는 궤양성 대장염 (UC)에 대한 장강환의 예방 효과가 연구되었으며 장강환이 마우스에서 DSS 로 인한 염증의 손상을 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 장강환은 마우스의 체중감소를 완화시키고, 회복기에 체중증가를 촉진시켜주며, 대장길이 단축량 및 대장무게를 감소시킬 수 있을뿐만 아니라 장강환은 마우스의 disease activity index (DAI) 도 조절하였다. 장강환은 전염증인자(interleukin (IL)-6, IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), cyclooxygenase-2 (COX-2), and nuclear factor kappa-B (NF-κB)가 혈청에서의 함량과 조직에서의 발현량을 감소시켰으며, 반대로, 혈청과 조직에서 IL-10 및 inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase-α（IκB-α）의 함량과 발현량을 증가시켰다. 그리고 대장조직에서 대장염증 바이오마커인 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)과 macrophage inflammatory protein-3α (MIP-3α)의 mRNA 발현량을 감소시켰다. NGS 분석에 의하면 장강환 그룹에서 Bacteroidetes 문 (phylum)은 감소시키고 Firmicutes 문 은 증가하였으며 유익한 박테리아인 Bifidobacterium, Lactobacillus 및 Akkermansia 속 등도 증가시키는 것으로 나타났다.

Chapter 2 에서는 lipopolysaccharide (LPS)가 유도하는 대장상피기능 장애가 있는 BALB/c 마우스에게 장강환을 투여하여 마우스의 체중과 음식섭취량을 측정하였다. Colonic paracellular permeability, 혈청 염증사이토카인, bacterial translocation 등 지표를 이용하여 장강환이 마우스 대장 상피기능에 대한 작용을 평가하였으며, 대장상피조직에서 발현하는 tight junction (TJ) 관련 유전자 occluding, claudin, zonula occludens (ZOs) proteins 과 junction adhesion molecules (JAM)의 발현량을 qPCR 과 western blot 을 이용하여 확인하였다. 실험 결과 장강환은 마우스의 간장, 비장, 및 장막림프절 조직의 부종을 완화하고, LPS 주사로 인한 마우스의 식욕부진과 설사를 감소시키는 것으로 나타났다. 장강환은 마우스의 음식 섭취량은 LPS 그룹의 3.7 ± 0.15 g/day 로부터 4.7 ± 0.21 g/day 로 증가하고 마우스의 대변 수분의 함량을 LPS 그룹 마우스보다 13.8 ± 1.23% 감소시켰다. 장강환은 LPS 로 인한 마우스의 염증반응을 감소하고, 대장의 상피세포를 보호하고, Fluorescent macromolecules 의 투과성은 LPS 그룹의 4 분의 1 이며, 대장조직에서 TJ 와 연관된 유전자의 mRNA 와 단백질의 발현량을 높이는 효과를 나타내었다.

Part 2 (chapter 3)에서는 bioinformatic 기술을 이용하여 network pharmacology 및 장강환이 궤양성 대장염에 미치는 영향에 대한 세포 실험을 기반으로 pathway 및 기전을 연구하였다. 본 연구에서는 장강환의 활성성분을 수집하고 Gene expression omnibus (GEO) 데이터베이스를 통해 건강한 사람과 UC 를 가진 사람 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 분석하고 UC targets 을 얻었다. 마지막으로, 교차 targets 유전자를 얻기 위해 장강환과 질병 targets 유전자들을 배치하였다. 교차 유전자는 Gene ontology (GO) 과 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)경로의 밀집 분석을 수행했으며 그 결과를 세포실험을 통해 검증되었다. 참고문헌검색, Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)데이터 검색을 통하여 장강환의 79 개의 활성성분 및 264 개의 활성 성분 targets 을 확인하고, UC 에서 발현의 차이를 보이는 유전자 910 개(P value＜0.005, |log2(fold change)| ＞1)를 선별하여 39 개의 교차 유전자를 선정하였다. 삼백초 중의 Quercetin 은 24 개의 교차 유전자와 잠재적 작용이 있으며, PTGS2 은 35 개 유효성분과 상호작용이 있었다. 교차유전자의 functional annotation 은 biological regulation, cellular process 와 binding 등과 연관이 있었다. 152 개의 밀집경로 결과 중 TNF 신호전달경로에서 IL-6, chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), matrix metallopeptidase 9 (MMP9), IL-1β, intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1), PTGS2, vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM1) 및 FOS 가 장강환이 항 대장염 억제 효과를 발휘하는 주요 경로 및 targets 유전자일 수 있다. 그리고 In vitro 실험을 통하여 CCD841CoN cell 항염증 targets 에 대한 장강환의 효과를 검증하였다.

Part 3 은 chapter 4 부분이며, 여기서는 장강환 중 함량이 제일 많게 검출된 활성화합물 pheophorbide A(phA)가 LPS 로 유도된 RAW264.7 cell 의 염증을 완화시키는 것을 증명하였다. 이 실험에서는 laser stimulation 이 없는 세 농도의 phA 를 사용하여 RAW264.7 cell 에서 LPS 로 인한 염증의 완화 효과를 연구하였다.

세포 형태, cell viability, 세포 상층액중 사이토카인 함량 및 NO 함량 측정, 세포 내 염증 관련 유전자들의 mRNA 발현량의 측정을 통하여 10 nM, 15 nM, 20 nM 농도의 phA 가 LPS 로 인한 세포손상을 억제하는 것을 발견하였고, 세포에서 NO 및 전염증인자 인 IL-1β, IL-6, FN-γ 과 TNF-α 의 분비를 감소시켰으며, 항염증인자 IL-10 의 함량을 증가시켰다. 한편 phA 는 RAW264.7 cell 에서 항염인자 유전자인 IκB-α 의 발현을 증가시키고, NF-κB 경로의 활성화를 억제하여 염증을 억제하였다. 전반적으로, phA 가 laser 에 의해 자극되지는 않았지만, 여전히 우수한 항염증 효과를 가지며 NF-κB 경로로 인한 염증 손상을 억제하여 phA 의 향후 개발 및 활용에 대한 새로운 아이디어를 제공했다.

결론적으로, 장강환은 한국 전통건강식품으로서 마우스의 대장에 대해 현저한 보호효과가 있을 뿐만 아니라 인체 대장세포 및 RAW264.7 cell 에 대해서도 좋은 항염증 효과 및 염증성 cytokine 을 감소하고 항염증성을 높여주며 NF-κB 활성을 낮춰주었다. 이러한 연구는 장강환의 응용과 보급에 이론적 근거를 제공한다고 하겠다.