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표제지

국문 초록

Abstract

목차

I. 서론 18

II. 재료 및 방법 20

1. 박테리오파지 분리 20

1.1. 숙주 세균 IMCC15298 배양 20

1.2. 박테리오파지 분리실험을 위한 해수시료 채취 24

1.3. 박테리오파지의 분리를 위한 농화 (enrichment) 배양 27

1.4. 단일 파지 분리를 위한 순수분리 28

2. 박테리오파지 유전체 분석 30

2.1. 박테리오파지DNA 추출 및 제한효소 절편길이 다형성분석 (RFLP) 30

2.2. 박테리오파지 형태학적 특성 34

2.3. 박테리오파지 유전체 염기서열 결정 및 유전체 조립 35

2.4. 박테리오파지 유전체 분석 36

III. 실험 결과 37

1. 박테리오파지의 분리 37

1.1. 파지 농화 (enrichment) 배양 및 순수분리 37

1.2. 형광현미경 관찰 37

2. 제한효소 절편 길이 다형성분석 (RFLP)의 분석 결과 41

3. 박테리오파지의 형태학적 특성 43

4. 세 가지 박테리오파지의 유전체 특징 45

5. 세 가지 박테리오파지의 비교유전체 분석 51

6. 세 개의 박테리오파지의 해양 환경에서의 분포 분석 62

IV. 결론 74

V. 참고문헌 76

표목차

Table 1. The composition of LNHM media used to cultivate host bacterium IMCC15298. 22

Table 2. Physicochemical parameters of the water samples collected from the Incheon pier. 26

Table 3. Sequence information about restriction site of the HaeIII endonuclease enzyme. 33

Table 4. Genomic characteristics of P15298-A, P15298-B and P15298-C. 47

Table 5. List of reference phages genomes related to P15298-A phages, identified using GRAViTy. 53

Table 6. List of reference phages genomes related to P15298-B phages, identified using GRAViTy. 54

Table 7. List of reference phages genomes related to P15298-C phages, identified using GRAViTy. 55

Table 8. List of viral metagenomic contigs related to P15298-A, identified from the IMG/VR database. 63

Table 9. List of viral metagenomic contigs related to P15298-C, identified from the IMG/VR database. 64

그림목차

Figure 1. Map of the sampling site of this study (Incheon Yeonan pier in South Korea).-37° 26'58.7"N 126° 35'34.6"E 25

Figure 2. A research scheme of this study. It is a P15298 bacteriophage study conducted in this study. 29

Figure 3. Growth curve of host bacteria co-cultured with the isolated bacteriophage. This is the growth curve measured by a flow cytometer after inoculation of enriched... 38

Figure 4. Growth curve of host bacteria co-cultured with the isolated bacteriophages in a large volume cultivation. Samples were measured by a flow... 39

Figure 5. Epifluorescence microscope image of bacteriophage isolated in this study. (a) Host strain IMCC15298 and infected bacteriophage P15298. Red arrow indicates... 40

Figure 6. Restriction fragment length polymorphism analysis of the extracted phage DNA. In the gel electrophoresis picture, the first lane indicates a 100 bp of DNA... 42

Figure 7. Transmission electron micrographs of bacteriophages isolated in this study. The morphology was confirmed by a transmission electron microscopy. The... 44

Figure 8. Assembly graphs of three phage genome sequences. Genomic sequences were submitted to Bandage program to predict assembled genomic contigs. 48

Figure 9. Genomic map of P15298-A, P15298-B, and P15298-C. (a) P15298-A, (b) P15298-B (c) P15298-C. Genomic map was created by Easyfig program referred to... 49

Figure 10. Sequencing coverages of the three phage genomes. The y-axis is sequencing coverage, and the x-axis is length (bp). (a). P15298-A, (b). P15298-B, (c). P15298-C. 50

Figure 11. Viral proteomic tree of the three bacteriophages. Based on the results of analysis by VipTree programs. (a). P15298-A, (b). P15298-B, (c). P15298-C. 52

Figure 12. Dendrogram showing the clustering of P15298-A with other isolated phage genomes. Phylogenetic analysis was conducted by GRAViTy programs... 56

Figure 13. Dendrogram showing the clustering of P15298-B with other isolated phage genomes. Phylogenetic analysis was conducted by GRAViTy programs... 57

Figure 14. Dendrogram showing the clustering of P15298-C with other isolated phage genomes. Phylogenetic analysis was conducted by GRAViTy programs... 58

Figure 15. Genomic similarities between bacteriophage P15298-A and other isolated phage genomes. Comparison of intergenomic similarity based on... 59

Figure 16. Genomic similarities between bacteriophage P15298-B and other isolated phage genomes. Comparison of intergenomic similarity based on... 60

Figure 17. Genomic similarities between bacteriophage P15298-C and other isolated phage genomes. Comparison of intergenomic similarity based on... 61

Figure 18. Blast-based genome sequence comparison between P15298-A and viral metagenomic contigs from the Delaware Bay and the North Sea. (a) Delaware Bay,... 65

Figure 19. Blast-based genome sequence comparison between P15298-A and viral metagenomic contigs from the Fram Strait and the Columbia River. (a) Fram... 66

Figure 20. Blast-based genome sequence comparison between P15298-A and viral metagenomic contigs from the Southern Ocean and the California coast. (a)... 67

Figure 21. Blast-based genome sequence comparison between P15298-A and viral metagenomic contigs from the Saanich Inlet, Botany Bay, and the Atlantic... 68

Figure 22. Blast-based genome sequence comparison between P15298-C and viral metagenomic contigs from the Pacific Ocean and the Georgia coast. (a)... 69

Figure 23. Blast-based genome sequence comparison between P15298-C and viral metagenomic contigs from the North Sea and the Chesapeake Bay. (a)... 70

Figure 24. Blast-based genome sequence comparison between P15298-C and viral metagenomic contigs from the Port Hacking. 71

Figure 25. Sequence similarities between P15298-A and marine viral metagenomic contigs. The highest similarity is Delaware Bay 51.6%, North Sea... 72

Figure 26. Sequence similarities between P15298-C and marine viral metagenomic contigs. The highest similarity was Pacific at 44.4% and... 73

초록보기

박테리오파지는 해양 환경에서 가장 풍부한 생물학적 개체이며 세균 군집의 구조 및 다양한 물질의 생지화학적 주기에 큰 영향을 미친다. 최근 증가한 해양 바이러스 메타게놈 연구는 해양 파지의 엄청난 다양성을 보여주었지만, 메타게놈을 통해 발견된 파지의 역할에 대한 해석을 위해서는 다양한 해양 우점 세균 그룹에 감염하는 파지의 분리 및 특징 규명이 요구된다. 본 연구에서는 해양 환경에서 우점하는 빈 영양 세균 그룹인 Gammaproteobacteria강 SAR92 분기군에 감염하는 박테리오파지의 분리와 유전체 분석을 통해 해양 바이러스 메타게놈 해석에 기여하고자 하였다. 숙주 세균 균주 IMCC15298은 동해에서 희석-소멸 고효율배양기법 (HTC)으로 분리 및 배양되었으며 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 계통학적 분석 결과 Gammaproteobacteria강 Porticoccaceae과의 SAR92 분기군에 속하는 것으로 확인되었다. IMCC15298을 감염시키는 박테리오파지는 인천 연안 표층 해수로부터 분리하였다. 먼저, 숙주세균 배양액에 채수한 해수 시료를 처리하여 파지의 농화를 수행했다. 이후 농화 배양액을 연속 희석하여 숙주 세균에 처리한 후, 유세포 분석기를 이용한 숙주 세균의 성장 저해 및 형광현미경을 이용한 파지 관찰을 통해 용균성 박테리오파지의 감염여부를 확인하였다. 분리된 파지를 대량 배양을 통해 증폭한 후 형태 관찰 및 유전체 분석을 수행했다. 투과전자현미경 관찰 결과, 약 180 nm 길이의 긴 비수축성 꼬리와 약 60 nm 직경의 icosahedral head를 가지는 Siphoviridae 계통의 파지가 주로 관찰되었다. Illumina와 Nanopore 플랫폼을 이용한 유전체 분석 결과, 3개의 파지 유전체 P15298-A, P15298-B, P15298-C가 얻어졌다. P15298-A, P15298-B, P15298-C는 각각 ~80 kb, ~59 kb, ~50 kb의 유전체 크기를 가지고 있었으며 G+C (%)는 각각 40.9%, 45.8%, 51.5%였다. 이 3개의 파지 유전체 모두 기존에 분리 및 배양된 파지와는 매우 낮은 유사성을 보였지만, P15298-A와 P15298-C는 태평양, 대서양 등 여러 해양 환경에서 얻어진 바이러스 메타게놈 콘티그 (contig)와 유사성을 나타냈다. 이는 본 연구에서 배양된 파지가 기존에 분리 및 배양된 적은 없지만 해양 환경에 널리 분포하는 파지 그룹을 대표할 수 있음을 나타낸다. 본 연구는 해양에 우점하는 세균 그룹인 SAR92에 감염하는 박테리오파지를 최초로 보고하였으며 확보된 파지 유전체 정보는 앞으로 해양 박테리오파지 연구에 소중한 자원이 될 것으로 기대된다.

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