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Title Page

Contents

ABSTRACT 12

I. INTRODUCTION 16

1. Pregnancy 16

2. Parturition 18

3. Preterm 20

4. Melatonin 22

5. Macrophage 25

II. MATERIALS AND METHODS 28

1. Animals 28

2. Establishment of a mouse model of preterm birth 28

3. Macrophage depletion using clodronate liposome 29

4. Cell culture 29

5. Isolation of bone marrow-derived macrophage 30

6. RNA preparation, RT-PCR, and real-time RT-PCR 31

7. Protein extraction and Western blotting 32

8. Flow cytometry 32

9. Immunocytochemistry 33

10. Analysis of cytokine array 34

11. Gene ontology enrichment analysis 35

12. Statistical analysis 35

III. RESULTS 43

1. Inflammation in the uterus provokes the inflammation-induced preterm birth (IPB) in mice 43

2. The population of various immune cells fluctuate before the IPB 50

3. M2 macrophage is reduced in the uterus in mice and women with the preterm birth 58

4. Partial depletion of uterine macrophage induced the preterm birth 64

5. Systemic administration of melatonin prevents the preterm birth, the adverse prenatal outcomes, and the production of pro-inflammatory cytokines in the IPB 68

6. Melatonin only restores the balance of M1/M2 ratio in the uterus of the mice with the IPB 75

7. Melatonin reduces the expression of factors to induce muscle contraction in macrophage 84

8. Melatonin suppresses the expression of contractile factors in the uterus of the mice with the IPB 92

9. Melatonin inhibits the M1 macrophage via p38 MAPK-Yap1 signaling 95

10. LPS do not disrupt the balance of M1/M2 ratio in macrophage-specific Yap1-knockout mice, resulting in term labor 100

IV. DISCUSSION 107

V. CONCLUSION 116

References 119

ABSTRACT IN KOREAN 144

List of Tables

Table 1. primer sequences for genotyping 36

Table 2. primer sequences for RT-PCR and real-time RT-PCR 37

Table 3. List of primary antibodies 39

Table 4. List of secondary antibodies 41

Table 5. List of antibodies for flow cytometry 42

List of Figures

Figure 1. Establishment of a murine model of the inflammation-induced... 46

Figure 2. The increased expression of pro-inflammatory cytokines... 49

Figure 3. The population of various immune cells in the maternal-fetal... 53

Figure 4. The fluctuated population of immune cells in the MFI before... 57

Figure 5. Comparison of gene ontology in women with the term or... 61

Figure 6. Reduction of the M2 macrophage in the mice with the IPB 63

Figure 7. Partial depletion of uterine macrophage resulting in the... 67

Figure 8. Prevention of the IPB after administration of melatonin 70

Figure 9. The anti-inflammatory effect of melatonin in the MFI of the... 74

Figure 10. Melatonin-induced repolarization of macrophage 79

Figure 11. Restoration for the population of the total, M1 and M2... 83

Figure 12. The decrease of contractile character in the uterine smooth... 88

Figure 13. Analyses of cytokine arrays with conditioned medium of... 91

Figure 14. The decreased expression of factors related to muscle.. 94

Figure 15. Inhibition of the phosphorylation of the factors related M1... 99

Figure 16. Decreased susceptibility to lipopolysaccharide (LPS) in... 104

Figure 17. Maintenance of the M1/M2 ratio after LPS injection in... 106

Figure 18. A schematic diagram illustrating a concept for the... 118

초록보기

사람의 경우, 조산은 37주 이전에 태아가 출산 되는 것을 말하며, 이는 다양한 이유에 의한 자궁 근육의 이른 수축에 의해 일어난다. 조산은 태아의 뇌 질환 과 미성숙 폐와 관련된 염증 질환에 원인이 된다. 현재 통용되는 치료제는 자궁 근육의 수축을 막는 것에 집중되어 있는데, 이는 효과가 크지 않으며, 모체에 다양한 부작용을 일으킬 수 있다. 그러므로, 새로운 치료제의 개발과 조산의 분자적 기전을 이해하는 것은 조산의 태아 관련 질병을 감소시키는 면에 필수적이다. Maternal-fetal tolerance 는 maternal-fetal interface (MFI) 에서 면역 레퍼토리에 의해 유지되는 동종 임신에 대한 모체에 의해 확립된 것으로 이 tolerance 가 무너지게 되면 조산이 일어날 수 있다. MFI 에 두번째로 많이 분포된 대식세포는 그들의 형태학적 및 기능적 특징에 따라 크게 M1 (전염증성 유형)과 M2 (항염증성/면역억제 유형), 2 가지 그룹으로 분류되며, 조산에서 대식세포의 역할에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다. 최근에, 멜라토닌이 생쥐 모델에서 조산을 억제할 수 있다는 연구가 보고되었지만, 아직 그 기전에 대해 알지 못한다. 그러므로, 이 연구의 목표는 멜라토닌이 MFI 내 대식세포의 극성을 조절함으로써 조산을 억제할 수 있다는 기전을 밝히고자 하는 것이다.

조산 생쥐 모델은 16.5 dpc 에 lipopolysaccharide (LPS)를 자궁 내로 주입하여 유도하며, 급성 염증을 일으킨다. LPS 는 조산을 효율적으로 유도시키며, 빠르면 주입 후 6 시간 뒤부터 조산이 일어나 태아가 사망하고, Il-1β, Tnfα, Cox2, Il-6 와 같은 급성 염증성 사이토카인들이 유의적으로 증가한다. 게다가, 조산이 일어나기 전 자궁 내에 면역세포들의 분포는 증가하거나 감소한다. 흥미롭게도, 조산 생쥐 모델에서 M2 대식세포는 유의적으로 감소하는데 이는 조산 환자에서도 같은 결과를 보인다. 15.5 dpc 에 약리학적으로 대식세포를 제거하기 위해서 임신한 생쥐의 자궁에 clodronate liposome 을 직접적으로 주입하였을 때, 조산이 일어난다. 멜라토닌의 주입은 조산율과 태아의 사망률 및 급성 염증성 사이토카인들의 발현을 상당히 감소시킨다. In vitro 실험에서 멜라토닌 선 처리는 LPS 로 유도된 M1 대식세포의 극성을 M2 대식세포로 유의적으로 재극성화시킨다. 게다가, 멜라토닌은 전체 대식세포와 M2 대식세포를 상당히 증가시켜, 염증이 유도된 조산의 자궁 내 대식세포 극성이 M1 으로 치우친 것을 회복시킨다. 그러나, M1/M2 대식세포의 비율을 회복시키는 멜라토닌의 효과는 decidua 나 placenta 에서는 자궁에서만큼의 효과는 보이지 않는다. 또한, 멜라토닌이 선 처리된 대식세포는 유의적으로 LPS 가 처리된 대식세포와 공 배양된 자궁 근육 세포의 액틴 섬유의 모양과, 조산 생쥐 모델의 자궁에서 수축 관련된 인자들의 발현을 회복시킨다. 일치하게도, CM 의 사이토카인 분석으로 멜라토닌이 LPS 에 의해 유도된 근육 수축을 일으킬 수 있는 사이토카인들의 분비를 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 멜라토닌 선 처리는 대식세포에서 M1 마커로 알려져 LPS 처리시 증가한 p38 MAPK, p65 of NF-κb, YAP1 (Y357)의 인산화를 유의적으로 감소시킨다. 또한, 멜라토닌 선 처리는 YAP1 (S127)의 인산화를 증가시켜 YAP1 의 분해를 증가시킨다. 흥미롭게도, Yap1 이 제거된 대식세포에서는 LPS 로 인한 유도가 결핍되어 있으므로 자궁 내 대식세포의 극성 균형이 유지되어, 대식세포 특이적으로 Yap1 이 제거된 생쥐에서는 LPS 로 인한 조산이 대부분 일어나지 않는다. 종합해보면, 자궁 내 대식세포의 극성 불균형은 조산의 병리학적 원인이 될 수 있으며, 멜라토닌은 대식세포의 극성 불균형을 회복시켜 조산을 일으키는 자궁 근육 수축을 막는다.

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