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논문명/저자명
Ex vivo expansion of human natural killer cells using cryopreserved irradiated K562-mbIL15-41BBL cells = 방사선 조사 이후 냉동보존된 K562-mbIL15-41BBL세포를 이용한 자연살해세포의 체외 증폭 / Hee Jo Baek
발행사항
광주 : 전남대학교 대학원, 2013.2
청구기호
TD 610 -13-843
형태사항
34 p. ; 30 cm
자료실
전자자료
제어번호
KDMT1201339119
주기사항
학위논문(박사) -- 전남대학교 대학원, Dept. of Medical Science, 2013.2. 지도교수: Hoon Kook, Duck Cho
원문
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Title Page

Contents

Abstract 4

INTRODUCTION 6

MATERIALS AND METHODS 8

1. Culture and irradiation of K562-mbIL15-41BBL feeder cells 8

2. Cryopreservation and thawing of irradiated K562-mbIL15-41BBL feeder cells 8

3. Expansion of NK cells from PBMCs 9

4. NK cell cytotoxicity assay 9

5. Flow cytometric analysis 11

6. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 11

7. Statistics 12

RESULTS 13

Expression of 4-1BB ligand and membrane-bound IL-15 on fresh and cryopreserved K562-mbIL15-41BB feeder cells 13

NK cell expansion rate and purity 13

Cytotoxicity of expanded NK cells 14

Expression of NK cell receptors on expanded NK cells 15

IFN-γ production by expanded NK cells 15

Survival of the fresh and cryopreserved irradiated K562-mbIL15-41BBL feeder cells and their frequency in the expanded NK cells. 16

DISCUSSION 17

CONCLUSION 22

REFERENCE 23

국문초록 28

Figures 30

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배경: 자연살해세포를 체외 증폭시키는데 감마선 조사된 배양보조세포가 이용된다. 하지만, 필요할 때마다 배양보조세포에 감마선을 조사하여 사용하는 것보다는 감마선 조사 후 냉동보존된 배양보조세포를 사용하는 것이 좀 더 편리하다. 이에 본 연구에서는 자연살해세포 증폭시 신선한 배양보조세포를 감마선 조사 후 이용한 경우(신선-자연살해세포군)와 냉동보존된 배양보조세포를 이용한 경우(냉동보존-자연살해세포군)를 비교 연구하였다.

재료 및 방법: 자연살해세포의 증폭을 위해 배양보조세포로 4-1BB 리간드와 막에 결합된 형태의 IL-15를 발현하는 K562-mbIL15-41BBL세포를 100 Gy의 감마선으로 조사한 후 사용하였다. 신선 및 냉동보존된 K562-mbIL15-41BBL 세포를 건강한 공여자의 말초혈액에서 분리한 단핵구 세포들과 혼합하고 IL-2와 IL-15를 첨가하여 3주 동안 공조 배양하여 자연살해세포의 증폭을 유도하였다. 신선한 K562-mbIL15-41BBL 세포와 냉동보존된 세포간에 4-1BB 리간드와 mbIL-15의 발현 정도를 유세포분석으로 비교하였다. 또한, 두군 간에 증폭된 자연살해세포의 다양한 악성종양 세포주에 대한 세포 독성검사, 자연살해세포의 수용체 발현 및 자연살해세포 증폭물에서의 K562-mbIL15-41BBL 세포 생존 정도를 유세포분석으로 비교하였다. 인터페론 감마의 생성은 ELISA 법으로 측정하였다

결과: 신선한 K562-mbIL15-41BBL 세포와 냉동보존된 세포에서 4-1BB 리간드는 비슷하게 발현되었으나, mbIL-15는 냉동보존된 K562-mbIL15-41BBL에서 낮게 발현되었다. 신선-자연살해세포군의 증폭율은 평균 908배이고 냉동보존 -자연살해세포군의 증폭율은 1,058배로 두 군간에 통계적으로 유의한 차이가 없었고, 배양 21일째 자연살해세포군의 순도는 신선-자연살해세포군에서 94.1%, 냉동보존-자연살해세포군에서 92.5%로 차이가 없었다. 다양한 악성종양 세포주들에 대한 증폭된 자연살해세포의 세포독성은 4:1, 2:1, 1:1의 작동세포:표적세포 비율에서 두 군간에 유의한 차이가 없었다. 자연살해세포의 수용체 발현과 인터페론-감마의 생성에도 두 군간에 차이가 없었다. 또한, 자연살해세포 증폭물에서 ITC+K562-mbIL15-41BBL의 빈도에 두 군간에 차이가 없었다.

결론: 이러한 결과는 자연살해세포의 체외증폭시 감마선 조사된 K562-mbIL15-41BBL 세포를 냉동보존하여 이용하는 방법과 신선한 세포를 이용하는 방법이 차이가 없음을 증명하였고, 이는 자연살해세포를 이용한 암면역 세포 치료를 위한 체외증폭법으로 매우 유용할 것으로 사료된다.

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