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Title Page
Abstract
Contents
I. Introduction 10
II. Materials & Methods 15
II.1. Strains and culture conditions 15
II.1.1. Strains 15
II.1.2. Culture media 15
II.2. Plasmids 16
II.3. Enzymes 16
II.4. Reagents 20
II.5. Primers and DNA sequence analysis 20
II.6. Site-directed mutagenesis 20
II.7. Integration vector 21
II.8. Transformations 24
II.8.1. Transformation of E. coli 24
II.8.2. Transformation of S. pombe 24
II.9. Detection of protein 25
II.9.1. Preparation of protein (NP-40 based extraction method) 25
II.9.2. Immunoprecipitation 25
II.9.3. Western blot analysis 26
II.10. S. pombe genomic DNA isolation 26
II.11. Spot assay 27
II.12. In situ hybridization 27
III. Results 33
III.1. Constructions of the strains for experiments 33
III.1.1. Construction of pREP41X-pmt3GG plasmid 33
III.1.2. Construction of PUX2 strain by Random Spore Analysis(△pmt3::kanr nup184-gfp::ura4+ /41X-pmt3GG)(이미지참조) 34
III.2. Analysis of nup184 serial truncated mutants 35
III.2.1. Phenotype of nup184 serial truncated mutants 35
III.2.2. SUMO modification of nup184 serial truncated mutants 40
III.3. nup184 point mutants 44
III.3.1. Construction of nup184 point mutants 44
III.3.2. Analysis of phenotype of nup184 point mutants 46
IV. Discussion 49
References 53
국문초록 56
Table 1. Strains used in this study 17
Table 2. Plasmids used in this study 19
Table 3. Primers used in this study 22
Table 4. Composition of media for S. pombe 29
Table 5. Buffers 31
Figure 1. Schematic diagram of the PUX2 strain 35
Figure 2. Schematic diagram showing the nup184 serial truncatedconstructs 37
Figure 3. Expression of serial deleted Nup184p::GFP 38
Figure 4. Growth test for nup184 serial truncated constructs by spot assay 39
Figure 5. Interaction of Nup184 with Pmt3 42
Figure 6. Interaction of sequencial truncated Nup184 with Pmt3 43
Figure 7. Schematic diagram showing the nup184 point mutatedconstructs 45
Figure 8. Growth test for nup184 point mutants 47
Figure 9. Poly(A)+ localization in nup184 sequential truncated and pointmutant cells(이미지참조) 48
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분열 효모인 Schizosaccharomyces pombe의 nup184 유전자는 핵공 복합체의 구성요소인 핵공 단백질이다. 핵공 복합체는 단백질로 이루어진 거대 조립체로써 핵막을 통과하고 있어 핵과 세포 질 사이의 물질 이동에 관여한다. nup184 유전자는 균주의 생장에 필수 적이지는 않지만 이 유전자의 결실 돌연변이는 완전배지에서 낮은 생장률을 보이고 mRNA의 세포질 수송에 결함을 보인다. nup184의 서열에는 총 7개의 SUMO consensus 서열이 존재하는데 이 서열은 SUMO 단백질이 결합할 수 있다. nup184 내에 존재하는 SUMO consensus sequences는 다음과 같다; 728LKTD, 1055VKLD, 1091FKHE, 1212VKED, 1554LKIE. SUMO는 97개의 아미노산으로 이루어진 작은 단백질이고 유비퀴틴과 유사하다. SUMO는 S. pombe와 S. cerevisiae에서 각각 pmt3와 smt3에 의해 암호화 되어있다. 이 단백질은 번역후 변형 과정에 관여하는 단백질로써 목표 단백질의 라이신 잔기에 결합하여 그 기능을 조절한다. SUMO 변형은 (SUMOylation) 세포 내 기능을 조절하는데 이에는 전사, DNA 손상 반응, 세포 주기, 핵 수송 등이 포함 된다. 이 연구에서 우리는 Nup184 단백질 이 SUMOylation 되는지에 관한 연구, 만약 그렇다면, SUMOylation이 Nup184의 기능에 미치는 영향에 관한 연구 등을 진행할 것이다.
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