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감사의 글
Contents
Abstract 11
I. Transduction of the tyrosine mutant form of ZAP-70 inhibits T cell activation 13
1. Introduction 13
2. Materials and methods 18
2.1. Construction of the Escherichia coli expression vector 18
2.2. Purification of recombinant protein 18
2.3. Cell preparation 19
2.4. Cell viability assay 19
2.5. Western blots 20
2.6. T cell activation 20
2.7. SEAP assay 21
2.8. ELISA for detecting the concentration of IL-2 21
2.9. Flow cytometric analysis of CD69 expression 22
3. Results 23
3.1. Transduction activity of the Hph-1-ZAP-70-Y319F mutant into 293T cells 23
3.2. The Hph-1-ZAP-70-Y319F mutant suppresses T cells activation 26
3.3. A synergic inhibitory effect of the combination with Hph-1-ZAP-70-Y319F and Hph-1-ctCTLA-4 on the T cell activation 28
4. Discussion 34
II. Delivery of a C-terminal truncated form of SLAP with the protein transduction domain HPH-1 down-regulates T cell signaling 36
1. Introduction 36
2. Materials and methods 40
2.1. Construction of the Escherichia coli expression vector 40
2.2. Purification of recombinant protein 40
2.3. Cell preparation 40
2.4. Immunoprecipitations 41
2.5. Proliferation assay 41
3. Results 42
3.1. Transduction activity of SLAP-T-mutant-Hph-1 into cells 42
3.2. SLAP-T-Hph-1 suppresses the activation of Jurkat T cells 42
3.3. SLAP-T-Hph-1 suppresses activation of primary T cells 48
4. Discussion 55
References 57
Abstract in Korean 68
Fig. 1.1. Schematic diagram showing mechanism of PTD fusion protein entry into the cell. The PTD fusion protein binds heparan sulfate or unknown receptors on the cell surface and enters either via endocytosis or macropinocytosis. The endocytic vesicles fuse... 14
Fig. 1.2. Signaling cascades stimulated by the TcR. Schematic depiction of key protein components of major signaling cascades that are stimulated following recognition of antigen by the TcR. Differential coloring identifies biochemical events and proteins with... 16
Fig. 1.3. Purification and transduction of Hph-1-ZAP-70-Y319F. (A) To purify Hph-1-ZAP-70-Y319F from the HMS174 E. coli strain, the culture was grown at 25℃ with IPTG and the lysate was loaded onto a HisTrap chelating column. The eluted protein was... 24
Fig. 1.4. Transduction of purified proteins into 293T cells. (A) Western blot analysis of the level of ZAP-70 in 293T cells 2 h after transduction of the purified proteins. Lane 1 : control; Lanes 2-5: induced cell lysates for Hph-1-ZAP-70-Y319F (50, 100, 200 and 500... 25
Fig. 1.5. Hph-1-ZAP-70-Y319F transduction results in impaired AP-1 and NFAT-mediated gene transcription. Measurement of SEAP in (A) AP-1 and (B) NFAT transfectants incubated with purified proteins (10, 50, 100, and 200 nM) and activated with... 27
Fig. 1.6. Transduction of Hph-1-ZAP-70-Y319F results in impaired IL-2 expression. The measurement of IL-2 in Jurkat T cells (A), primary CD4+ T cells (B), and CD8+ T cells (C) incubated with purified proteins (10, 50, 100, and 200 nM) and activated with plate-bound...(이미지참조) 29
Fig. 1.7. Hph-1-ZAP-70-Y319F induces decreased CD69 on T cells in a concentration-dependent manner. Jurkat T cells (A), primary CD4+ T cells (B), and primary CD8+ T cells (C) were incubated with purified protein (200 nM) for 2 h and stimulated by plate-bound...(이미지참조) 30
Fig. 1.8. Hph-1-ZAP-70-Y319F and Hph-1-ctCTLA-4 induce decreased CD69 on T cells synergistically. (A) Jurkat T cells were incubated with Hph-1-ZAP-70-Y319F and Hph-1-ctCTLA-4 and stimulated by plate-bound anti-CD3 plus anti-CD28 for 18 h.... 31
Fig. 1.9. Hph-1-ZAP-70-Y319F and Hph-1-ctCTLA-4 reduce IL-2 production by T cells synergistically. (A) Jurkat T cells were incubated with Hph-1-ZAP-70-Y319F and Hph-1-ctCTLA-4 and stimulated by plate-bound anti-CD3 plus anti-CD28 for 18 h.... 33
Fig. 2.1. Presentation of an antigen by the major histocompatibility complex (MHC) to a T cell initiates the formation of a supramolecular-activation complex (SMAC), which is also known as the immunological synapse. T-cell-receptor (TcR) activation... 38
Fig. 2.2. Purification and transduction of SLAP-T-Hph-1 protein. (A) To purify SLAP-T-Hph-1 and SLAP-T in the Star (DE3) pLysS E. coli strain, the culture was grown at 25℃ with IPTG. The lysate was loaded on a HisTrap chelating column. The eluted... 43
Fig. 2.3. Transduction of purified proteins into Jurkat T cell. (A) Western blot analysis of the level of SLAP in Jurkat T cells 2 h after transduction of purified proteins. The cells were lysed with lysis buffer, and the lysates were resolved by 12.5% SDS-PAGE and... 44
Fig. 2.4. Effect of SLAP-T-Hph-1 and SLAP-T in Jurkat T cells. Western blot analysis of ZAP-70-Tyr319, LAT-Tyrl91, and Erk phosphorylation. Jurkat T cells were treated with SLAP-T-Hph-1 and SLAP-T (2 × 105/microtube/100 ㎕). Four hours after transduction,...(이미지참조) 46
Fig. 2.5. SLAP associates with ZAP-70 and LAT upon TcR activation. (A) SLAP-T-Hph-1 and SLAP-T-treated Jurkat T cells wete activated with anti-CD3 and CD28 antibody. Anti-HA antibody was added to 200 ㎕ of cell lysate and incubated with gentle rocking... 47
Fig. 2.6. Transduction of SLAP-T-Hph-1 results in impaired AP-1 and NFAT-mediated gene transcription. Measurement of SEAP by (A) AP-1 and (B) NFAT in transfectant incubated with the indicated concentrations of purified proteins (Lanes 3-5: SLAP-T-Hph-1,... 49
Fig. 2.7. SLAP-T-Hph-1 induces decreased expression of CD69 and IL-2 production on Jurkat T cells. (A) Jurkat T cells were incubated with purified proteins (4 μM) and stimulated with plate-bound anti-CD3 plus anti-CD28 for 18 h, and CD69 expression was... 50
Fig. 2.8. Viability and proliferation of purified protein-treated mouse splenocytes. (A) Mouse splenocytes were treated with the indicated concentrations of SLAP-T-Hph-1 and SLAP-T for 72 h. Cell viability was monitored by WST-8 assay. (B) Mouse splenocytes... 52
Fig. 2.9. Inhibition of CD69 expression by SLAP-T-Hph-1 in primary T cells. Primary CD4+ or CD8+ T cells were purified from mouse splenocytes using a MACS column with CD4 or CD8 microbeads. Mouse primary CD4+ (A) or CD8+ (B) T cells were incubated...(이미지참조) 53
Fig. 2.10. Inhibition of IL-2 secretion by SLAP-T-Hph-1 in primary T cells. Primary CD4+ or CD8+ T cells were purified from mouse splenocytes using a MACS column with CD4 or CD8 microbeads. Mouse primary CD4+ (A) or CD8+ (B) T cells were incubated...(이미지참조) 54
초록보기 더보기
일반적으로 진핵 세포의 세포막은 대부분의 펩타이드와 단백질이 통과할 수 없는 것으로 알려져 있다. 하지만 단백질 전달체는 짧은 펩타이드로 구성되며 단백질을 비롯한 거대분자들을 세포 내로 도입할 수 있다. 단백질 전달체 융합 단백질은 세포질과 핵에 모두 축적되며 고전적인 유전자 전달 방법을 통한 세포 내로의 유전자 전달의 한계점들을 극복할 수 있다. 우리는 여러 전사인자로부터 유래된 펩타이드 중에 인간 전사 인자로부터 새로운 단백질 전달체인 Hph-1을 개발하였다. 이 단백질 전달체는 거대 분자 물질인 β-galactosidase를 세포 내로 도입시킬 수 있고 세포 내로 전달 시 세포질과 핵 내로 전달되게 된다. 이는 기존의 살아있는 세포에 유전자 전달 방법에 비해 많은 장점을 갖는다.
ZAP-70은 Syk 계열의 세포질 내 단백질 효소로 T 세포의 발달과 활성화에 매우 중요한 인자이다. 사람의 ZAP-70의 Y319F 변형인자는 T 세포의 활성화를 저해한다는 것이 알려져 있다. 우리는 이 변형 단백질에 Hph-1을 결합시킨 융합 단백질을 T 세포에 전달하여 T 세포 내에 존재하는 ZAP-70-Tyr319, LAT-Tyr191 그리고 44/42 MAPK (Erk1/Erk2)의 인산화를 저해하였고 이 융합 단백질의 전달을 통해 NFAT와 AP-1을 통한 유전자 전사가 저해됨을 확인하였다. 또한 T 세포의 활성화 표지인자인 CD69의 발현 또한 저해됨을 확인하였고 T 세포의 활성화의 주요 인자인 IL-2 싸이토카인의 생산 또한 현저히 저해됨을 확인하였다.
Src-like adapter protein (SLAP)은 Src 계열 효소의 매우 유사한 구조를 가지는 adaptor 단백질이다. SLAP은 T 세포 내에서 발현되며 Jurkat T 세포 주에서 발현 시 T 세포 수용체를 통한 신호 전달을 저해하여 NFAT와 AP-1과 같은 전사 인자와 IL-2를 통한 전사를 저해한다. SLAP 단백질의 말단 특이 부분을 제거한 변형 단백질 또한 과발현 시에 T 세포의 활성화를 저해하는 것이 알려져 있으며 우리는 이 변형 단백질을 Hph-1과 융합한 단백질을 생산하였다. 이 융합 변형 단백질을 T 세포를 전달하면 또한 NFAT 그리고 AP-1을 통한 유전자 전사를 저해하며 T 세포의 활성화 표지인자인 CD69의 발현 또한 저해됨을 확인하였다. 또한 T 세포의 활성화의 주요 인자인 IL-2 싸이토카인의 생산 또한 현저히 저해됨을 확인하였다.
이러한 결과들을 통해 이 융합 단백질들이 T 세포를 통한 자가 면역 질환과 과다 면역 반응을 치료할 수 있는 새로운 T 세포 특이적 면역 억제제의 후보 물질로의 개발이 가능함을 확인하였다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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