표제지
목차
보고서 요약 2
요약문 3
SUMMARY 6
제1장 연구개발과제의 개요 22
1절. 연구개발의 배경 및 필요성 22
1. 배경 22
2. 필요성 23
2절. 연구개발의 내용 및 범위 24
1. 연구개발 목적 24
2. 연구개발 내용 및 범위 24
제2장 국내외 기술개발 현황 30
1절. 국내외 관련분야에 대한 기술개발 현황 30
1. 국내 현황 30
2. 국외 현황 31
3. 현 기술의 문제점 32
2절. 본 연구결과가 국내외 기술개발 현황에서 차지하는 위치 32
제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 34
1절. 수산생물자원의 종 및 원산지 판정을 위한 유전자정보 발굴 34
1. 상용화 제품에 탑재될 수산생물 그룹 확정 34
2. 상용화 제품에 탑재될 수산생물 시료확보 및 염기서열 분석 34
2절. 자성-금속 나노복합체를 이용한 전기화학 센서 제작 34
3절. 자성-금속 나노복합체를 이용한 특이 DNA 반응 색깔센서 제작 36
1. 나노입자 및 DNA hybridization 최적화 36
2. 원산지 및 종 판별이 가능한 on-off 키트 개발 및 이의 실용화 37
3. 종판별 키트에 사용되는 자성나노입자 합성 37
4절. 유전자 추출 기술 최적화 및 안정화 38
5절. 유전자 증폭 기술 최적화 및 안정화 40
6절. 유전자 판독 기술 최적화 및 안정화 41
1. Capture probe DNA 고정화 및 조건 최적화 41
2. Target DNA 혼성화 41
3. 전기적 신호 증폭을 위한 조건 최적화 44
7절. 일체형 미세유체 디바이스 제작 46
8절. 일체형 미세유체 디바이스 제어 시스템 개발 49
9절. 디바이스 상용제품 제조기술 확립 49
10절. 판독기 상용제품 제작기술 확립 50
11절. 일체형디바이스 1차 설계 및 제작 50
1. 디바이스 설계 개념 50
2. 디바이스 1차 설계 및 제작 51
3. 디바이스 1차 설계 변경 및 변경된 디바이스 제작 51
4. Probe-DNA 탑재 시스템 구축 52
12절. 일체형디바이스 성능평가 및 개선안 도출 52
1. 필름 챔버를 이용한 유전자 증폭 및 판독 평가 52
2. 1차 디바이스의 유전자증폭/혼성화/전기화학판독 평가 53
3. 필름채널용 밸브개발 53
4. Air 제거 필터 개발 54
5. 요소기술 적용 상용제품 제작 55
13절. 일체형디바이스 상용제품 설계 및 제작 55
1. 디바이스 설계 55
2. 디바이스 제작 55
14절. 일체형디바이스 상용제품 성능평가 및 최적화 56
1. 기 보유중인 어류 시료 상태 점검 56
2. 필름챔버에서 유전자 증폭 평가 56
3. 금전극 표면의 전기적 상태 평가 57
4. Capture Probe DNA 고정화 평가 57
5. Target 유전자 혼성화 평가 59
6. Real sample을 이용한 일체형 유전자칩 평가 59
7. 유전자판독칩 장기보관성 평가 61
15절. 판독기 1차 설계 및 제작 61
1. Pork Pin 기반 Probe station 제작 61
2. 휴대형 전기화학판독 시스템 제작 62
16절. 1차 판독기 성능평가 및 개선안 도출 62
1. Probe station 성능 평가 62
2. 전기화학판독시스템 평가 62
17절. 판독기 상용제품 설계 및 제작 63
1. 제품설계 63
2. 자동 제어를 위한 전자보드 제작 64
3. 구동부(PCR, Pump, Syringe)에 대한 절전 기능 설정 64
4. 안드로이드 기반 테블릿을 통한 사용자 인터페이스 및 데이터 관리 64
5. 내부 밧데리 구동 및 외부 전원 동시 사용 64
6. 정속, 정량의 고정밀 SYRINGE 구현을 통한 Buffer 용액 주입 65
7. 유로막음 장치를 통한 PCR 열손실 최소화 65
8. CV 전극 측정시 안정적인 MUX 기능 구현 65
9. POGO핀을 이용한 용이한 측정 65
10. DUAL PELTIER CONTROL 알고리즘으로 PCR 최적화 65
18절. 판독기 상용제품 성능평가 및 최적화 66
1. 판독기 성능평가/최적화 66
2. 판독기 제어 UI 최적화 66
3. 판독기 케이스 부착 및 판독칩 11종 제작 67
19절. 수산생물 종 및 원산지 판별용 DNA chip 개발 67
1. 상용화 제품에 탑재될 그룹별 수산생물 DNA chip 제작 및 Probe 검정 67
2. 확보된 염기서열 정보를 활용한 분류군별 종 판별용 DNA chip 제작 및 검증 68
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 70
1절. 연구개발목표의 달성도 70
2절. 관련 분야의 기술발전에 대한 기여도 70
제5장 연구개발결과의 활용계획 72
1절. 추가연구의 필요성 72
2절. 타 연구에의 응용 72
3절. 기업화 추진방안 72
제6장 참고문헌 73
표 1. Cytochrome Oxidase 1(COI) 염기서열 분석에 사용한 프라이머 정보 25
표 2. 분류군별, 어획량별 및 수입량등을 고려한 수산생물 Group list 67
표 3. Group 3 생물종의 Candidate probe list 69
그림 1. 종 판별용 probe 선별 방법 25
그림 2. 종 판별용 DNA chip 개발을 위한 flow-chart. 26
그림 3. 고감도 마이크로 PCR을 이용한 기능 통합화된 LOC chip 및 핵심요소기술. 26
그림 4. 유전자증폭 및 검지용 미세유체 디바이스를 위한 미세유체/밸브 조합 시스템 모식도. 27
그림 5. 자성 나노입자와 바이오물질 결합 반응에 대한 모식도 27
그림 6. 발색 나노입자와 바이오물질 결합 반응에 대한 모식도 28
그림 7. 자성 나노입자와 발색 나노입자를 이용한 선택적인 DNA 추출 모식도. 28
그림 8. 발색-자성 나노초구조체 및 디바이스 설계 모식도. 28
그림 9. Gradient-generating/microarray 통합형 lab-on-a-chip 29
그림 10. 휴대형 DNA바코드 독해장치 31
그림 11. 미국 코넬 대학 Dan Luo 박사팀이 개발한 나노 DNA바코드. 32
그림 12. 일본관리라벨에서 생산하고 있는 DNA라벨. 32
그림 13. 염기서열 분석에서 나타난 종내 변이 및 SNP 영역의 제거 34
그림 14. 참홍어와 남미산 홍어간의 종간, 종내 염기서열 비교 34
그림 15. 자성-금속 코어쉘 입자의 정렬 및 이의 DNA 센서 제작 35
그림 16. 나노 자성입자 와이어의 AFM 사진(A), 나노 자성입자 와이어의 cross-sectional profile (B), 전극 사이를 연결하는 나노 자성입자 와이어의 AFM 사진 (C), MFM 사진 (D). 35
그림 17. 나노 자성입자 와이어의 core-shell 구조 large scale SEM 사진 (A), small scale SEM 사진 (B), 전극 사이를 연결하는 나노 와이어 large scale SEM 사진 (C), small scale SEM 사진(D). 35
그림 18. 자성-금속 나노어레이의 DNA 센싱 시연 36
그림 19. 자성-금속 나노복합체를 이용한 색깔센서 제작 36
그림 20. DNA센싱 전과정에 대한 시간대별 모식도 36
그림 21. Target DNA를 나노입자 어레이를 이용한 센서의 정량 및 정성 분석 37
그림 22. 자성-금속입자 프로브를 이용한 어류 종판별 DNA 센서의 제작원리 및 모식도 37
그림 23. Streptavidin을 이용한 자성 입자 표면 개질 모식도 37
그림 24. Streptavidin을 이용한 자성 입자 표면 개질 결과 38
그림 25. 0.1nM–1.0μM 농도 구간에서의 DNA 색깔 탐지 센서 검량곡선(A), 선택적 DNA 탐지에 따른 UV-vis 흡광곡선의 변화 (B). 38
그림 26. 자체 제작된 카트리지 타입 DNA 센서 38
그림 27. 자성나노입자를 이용한 어류 유전자 순도향상 기술개발 39
그림 28. 희석된 양에 따른 Au-Fe3O4 NPs 색변화를 관찰 39
그림 29. 희석된 양에 따른 Au-Fe3O4 NPs 색변화 UV-Vis spectrophoometric 관찰 39
그림 30. Agarose gel을 이용한 Au-Fe3O4 Nanoprobes에 DNA가 붙는 것을 확인 39
그림 31. Agarose gel을 이용한 Au-Fe3O4 Nanoprobes에 DNA 부착 정성/정량 분석 40
그림 32. 폴리도파민과 실리카 나노파티클을 이용한 유전자 증폭 40
그림 33. 폴리도파민과 실리카 나노파티클을 이용한 유전자 증폭 효율 향상 41
그림 34. 금전극 표면에서의 target DNA 검출 과정 41
그림 35. Target DNA의 상보적 결합 후 줄어든 전기적 신호 42
그림 36. 다양한 어종에 대하여 target DNA 혼성화 후 전기적 신호 측정 42
그림 37. 온도에 따른 Target DNA 혼성화 반응; 상온 & 57 ℃ 42
그림 38. Target DNA 길이에 따른 혼성화 정도 비교; real target (800 bp) vs. artificial target (25 bp) 43
그림 39. 다양한 어종에 대해 Target DNA 길이에 따른 혼성화 정도 비교; real target DNA (800 bp) vs. artificial target DNA (25 bp) 43
그림 40. 메틸렌블루를 이용한 전기적 신호 테스트 43
그림 41. 메틸렌블루를 이용하여 도출되는 전기적 신호 44
그림 42. 메틸렌블루를 이용한 다양한 어종 테스트 44
그림 43. Washing 조건에 따른 전기적 신호 테스트 44
그림 44. 동일한 칩에서 어류 2종 동시 테스트 결과 45
그림 45. 동일한 칩에서 어류 16종 동시 테스트 결과 45
그림 46. 지노첵 분류칩 group #9: 어류 6종 동시 테스트 결과 46
그림 47. 나노필러전극을 이용한 전기적 신호 검출 46
그림 48. 필름기반 다층 미세유체 디바이스 제작 공정 47
그림 49. 8인치 크기로 제작된 미세유체 디바이스(좌), 미세유체 체널의 단면 전자현미경 사진 (우) 47
그림 50. 필름기반 다층 미세유체 디바이스에 컬러잉크를 주입한 모습 47
그림 51. 일체형 미세유체 디바이스 설계안 (1차설계) 48
그림 52. 일체형 미세유체 디바이스 설계 확정안 (2차설계) 48
그림 53. 일체형 미세유체 디바이스 시제품 49
그림 54. 일체형 미세유체 디바이스 제어 시스템 구축 49
그림 55. 디바이스 상용제품 제조공정 구성도 50
그림 56. 판독기 시스템 상용제품 제조공정 구성도 50
그림 57. 일체형 유전자판독 디바이스 기능도와 설계도 51
그림 58. 디바이스 1차 기능도와 설계도 작성 51
그림 59. 3장의 필름으로 구성된 디바이스 제작 51
그림 60. 디바이스 1차 설계변경 및 하이브리드형 디바이스 제작 52
그림 61. Probe DNA 탑재용 3축 스테이지 설계도 52
그림 62. 필름챔버를 이용한 유전자 증폭 실험 셋업과 유전자 증폭 결과 53
그림 63. 필름기반으로 1차 디바이스(좌)의 PCR결과(중)와 전기화학판독결과(우) 53
그림 64. 볼 베어링을 이용한 필름채널용 밸브 구조 54
그림 65. 볼 베어링을 이용한 필름채널용 밸브 동작 평가 54
그림 66. PCR챔버 밀폐성 향상을 위한 복층형 밸브 개발 54
그림 67. 소수성 필터를 이용한 미세채널 내 Air 제거용 필터 시스템 개발 54
그림 68. 밸브, Air필터, 프레임이 적용된 디바이스 시제품 제작 55
그림 69. 유전자판독 디바이스 상용제품 설계 55
그림 70. 유전자판독칩 상용제품 제작 55
그림 71. 기 보유한 20어종 생선샘플의 상태 확인 56
그림 72. 튜브방식 유전자증폭과 필름기반 유전자증폭 비교 57
그림 73. 통합칩 금전극에서 전기화학신호 확인 57
그림 74. 금작업전극에서 capture probe DNA 고정화 여부 확인 58
그림 75. 20어종 생선샘플의 capture probe DNA 고정화 여부 확인 58
그림 76. 통합칩에서 해당목적어종 유전자의 혼성화 여부 확인 59
그림 77. 수산과학원에서 선별어종 수령한 생선샘플 및 정보 60
그림 78. 생선샘플 이용 유전자 추출 및 튜브type 유전자증폭 결과 60
그림 79. 생선샘플의 튜브기반 & 필름기반 유전자 증폭 결과 비교 60
그림 80. 일체형 유전자판독칩에서의 유전자 증폭결과 및 혼성화 결과 61
그림 81. Capture probe DNA 보관안정성 테스트 결과 61
그림 82. Pork Pin 기반의 Probe Station 제작 61
그림 83. Pork-Pin Probe Station(좌), 전기화학 측정시스템(우) 제작 62
그림 84. Pork Pin 기반 Probe Station을 이용한 전기화학 측정 결과 62
그림 85. 신규시스템을 이용한 전기화학 측정 결과 63
그림 86. 유전자판독기 상용제품 설계도 63
그림 87. 각종 모듈 이미지 64
그림 88. 전자보드 전체 구성 64
그림 89. 정속/정량 syringe 모듈, PCR 밸브 모듈 65
그림 90. MUX구현 RELAY 모듈/33 Pork Pin Array 65
그림 91. 개별 부품들이 조립된 시제품 사진 66
그림 92. 판독기 상용제품 성능평가 및 최적화 진행 66
그림 93. 유전자 판독기 제어 UI 화면 최적화 67
그림 94. 유전자 판독기 및 유전자 판독칩 11종의 최종 제품 사진 67
그림 95. Group 1 생물종의 DNA chip 분석 68
그림 96. Group 2 생물종의 DNA chip 분석 68