암을 치료하기 위해 암세포를 직접적인 타겟으로 하지 않으며 면역 반응을 강화하여 부작용을 최소화하는 면역치료가 유망한 전략이 될 수 있다. 이때 면역반응을 강화하기 위해서는 암 미세환경을 개선하는 것이 하나의 전략이 될 수 있다. 세포밖소포체는 모세포의 특징을 반영하여 세포 간 통신을 담당하며, 특히 면역세포는 종양의 진행을 억제하고 면역 조절 작용을 자극을 위해 세포밖소포체를 방출한다고 알려져 있다.

본 연구에서는 다양한 방법으로 염증성 대식세포 유래 세포밖소포체(M1EV) 표면에 인터루킨-2(IL-2)를 표지하여 암 면역치료제로써 제안하고 있으며, 이는 암 미세환경에서 상대적으로 고갈된 염증성 대식세포(M1)및 T 세포를 확장하고자하였다. 세포밖소포체를 얻기 위한 세포로는 종양의 성장을 억제할 수 있다고 알려진 염증성 대식세포를 선택하였다. 추가적인 변형으로는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 사이토카인을 세포밖소포체 표면에 표지 하였다. 따라서 M1EV 를 기반으로 하여 종양관련 대식세포(M2)를 염증성 대식세포로 재프로그래밍을 유도하고 표면에 표지된 인터루킨-2 로 T 세포를 자극하여 암 미세환경을 개선하고자 하였다.

표면에 인터루킨-2 가 표지 된 염증성 대식세포 유래 세포밖소포체(M1EV-IL2)를 얻기 위한 첫번째 방법으로, 유전자 조작을 하기 위해 렌티바이러스 기반 형질도입 방법을 이용해 감염된 세포로부터 방출되는 세포밖소포체 표면에 인터루킨-2 가 표지 되도록 유도하였다. 두번째 방법은 화학반응을 기반으로 한 방법으로, N3 와 DBCO 간의 생물학적 직교 클릭 화학반응을 이용하였다. DBCO-IL2 는 EDC/NHS 반응으로 제작되었고, M1EV 표면에 N₃ 를 표지하기 위해서 두가지 방법을 이용하였다. 먼저 글라이칸을 세포에 처리하여 조작된 세포로부터 유래된 세포밖소포체 표면에도 N3 가 표지 되도록 하였다. 또 다른 방법으로는 M1EV 표면에 DSPE-PEG-N3 가 끼어 들어가도록 유도하여 EV 표면에 N3 가 표지 되도록 하였다. M1EV 가 불순물 단백질과 구분되어 분리되었으며, 변형 방법에 관계없이 변형 전 후 EV 의 크기나 분산도 값의 유의한 변화를 일으키지 않았다. EV 의 특성에 변화를 끼치지 않고 EV 의 변형이 진행되었음을 의미한다.

종양 관련 대식세포(M2)의 염증성 대식세포(M1)로의 M1EV 의 재프로그래밍 효과를 확인하기 위해 종양 관련 대식세포(M2)에 M1EV 및 M1EV-IL2를 처리하였다. 종양 관련 대식세포(M2)에 M1EV 및 M1EV-IL2 를 처리하였을 때, M1 마커(IL-1β, CXCL10)가 증가하였고 M2 마커(CD206)가 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 일반적인 염증성 대식세포와 비슷한 수준까지 변화한 것을 확인하였다. 따라서 M1EV-IL2 가 암 미세환경에서 우세한 종양 관련 대식세포(M2)가 종양을 억제할 수 있는 기능이 있는 염증성 대식세포(M1)로 재프로그래밍하여 암 미세환경을 개선할 가능성일 보유하고 있음을 의미한다.

또한 M1EV-IL2 가 면역활성화와 관련된 도움(CD4+) T 세포의 활성화를 유도할 수 있는 지 시그니처 사이토카인인 IL-2 및 IFN-γ mRNA 의 상대적 발현을 확인하였다. M1EV-IL2 를 처리하였을 때, IL-2 및 IFN-γ mRNA 발현이 대조군에 비해 상대적으로 증가되었다. 도움(CD4+) T 세포뿐만 아니라 세포독성(CD8+) T 세포의 활성화를 유도하는 것 역시 암 면역치료에서 중요하다. 따라서 비장에서 naïve CD8+ T 세포를 분리하여 M1EV-IL2 를 평가하였다. M1EV-IL2 를 같이 처리하였을 때 대조군에 비해 CD8+ T 세포의 세포증식을 촉진하였고, 활성화 마커의 mRNA 발현이 상대적으로 증가하였다. mRNA 발현의 증가와 더불어 실질적으로 방출된 IFN-γ 의 양 역시 증가하였다. 이는 M1EV 표면에 표지된 IL-2 의 기능으로써 CD8+ T 세포의 세포증식 촉진과 활성화를 유도할 수 있음을 의미한다.

M1EV 의 종양 관련 대식세포(M2)로부터 염증성 대식세포(M1)로의 재프로그래밍 기능에 추가적으로 표면에 IL-2 를 표지함으로 인해 T 세포의 활성화를 유도할 수 있었다. 이처럼 세포밖소포체를 추가적으로 조작하여 치료적 잠재력 및 면역치료 효능을 더욱 향상시킬 수 있었으며 면역치료제로서 적용 가능성을 확인하였다.