태국과 라오스에서 전통적으로 사용되어 온 흑생강(Kaempferia paviflora)은 생강과(Zingiberaceae)에 속하며 주로 태국, 베트남 및 라오스에서 재배된다. 특히 흑생강의 뿌리줄기는 식물의 주요 부분이며 많은 양의 활성 성분을 포함한다. 그 중 주요 성분으로는 DMF, TMF, PMF3 종을 포함한 폴리메톡시플라본과 같은 28 개의 플라보노이드를 포함한다. 지금까지 연구된 흑생강의 다양한 효능을 고려할 때 흑생강은 다양한 질병 치료에 효과적인 잠재적인 물질로 기대된다. 그 중 피부에 대한 보호효과와 관련하여 흑생강은 주요성분과 함께 UVB 유발 산화스트레스로부터 피부를 보호하는 잠재적인 항산화제 공급원으로 밝혀졌다. 이전 연구에서는 흑생강 추출물에 존재하는 또다른 항산화제인 DMF가 Hs68 인간 진피 섬유아세포에서 UVB 로 자극된 ROS 생성을 억제한다고 밝혔다. 그러나 흑생강 추출물의 다른 두 메톡시플라본인 TMF 와 PMF 는 DMF 와 플라본 골격은 유사하지만 피부 손상 방지 효능에 관한 연구는 현재까지 제한적이다. 피부 보호 효과에 대해 알려져있는 DMF 와, TMF 및 PMF 와의 화학적 구조의 유사성을 바탕으로 이러한 화합물의 화학 구조가 피부 보호 효과와 관련이 있는지 실험하였다.
이온성액체는 양이온과 음이온으로 이루어진 독특한 액체상태의 염으로써, 높은 열안정성과 비휘발성 그리고 친 환경적이라는 특징을 가진다. 환경 친화적인 용매의 요구에 적합한 많은 특징을 가지고 있어 전 세계적으로 관심이 증대되고 있으며, 기존의 유기용매가 지니지 못하는 다양한 특성을 가지고 있다.
본 실험에서는 흑생강에서 가장 함량이 높은 주성분 3 종을 단일성분으로 분리하는 새로운 방법을 연구하고자 하였다. 기존의 유기용매만 사용하였을 때는 단계가 복잡하고 시간이 오래 걸린다는 점을 개선해 보고자 여기에 이온성액체를 접합하여 색다른 시도를 하였다. 이온성액체 EMIMBR 에 70 % 메탄올(MeOH)을 cosolvent 로 사용하여 ultrasonic extraction 을 하였다. 또 결정화 실험을 통하여 원하는 주성분만 선택적으로 enrichment 시켰다. 반용매(Anti-solvent)로는 acetonitrile 을 사용하였다. 또한 이를 각각의 단일성분으로 분리하기 위하여 Preparative HPLC 를 사용하였다. 이를 통하여 본 실험에서는 흑생강 주성분 3 종을 분리하는 새로운 고효율 분리 방법을 개발하였다.
앞선 실험에서 분리한 흑생강에서 함량이 높은 주성분 3 종에 대한 인간 진피섬유아세포에서의 TNF-α 로 인한 HDFs 손상에 대해 보호 효과를 발휘하는지 확인하였다. Positive control 로는 항산화 플라보노이드로 잘 알려진 Quercetin 을 사용하였다. 실험에 적합한 농도의 범위를 선정하기 위하여 Cell viability 실험을 진행하여 후속 실험에 사용되는 최대 선량은 12.5μM 로 설정되었다.
HDFs 에서 TNF-α induced ROS 생성에 대한 DMF, TMF 및 PMF 의 억제 효과를 조사하고 이들 성분의 항산화 활성과 화학 구조 사이의 상관관계를 분석한 결과 동일한 2- phenylchromen-4-one backbone 을 가진 화합물로 처리하면 메톡실기의 수에 비례하는 효과만큼 ROS 억제가 유발되었다. 하지만, 이들 폴리메톡시플라본의 ROS 형성 억제 효능은 PMF 와 위치 및 치환수가 유사한 flavone 인 Quercetin(positive control)보다 낮았다.
HDFs 에서 TNF-α 에 의해 유도된 MMP-1 의 mRNA 발현과 분비 실험 결과 TMF 가 MMP-1 의 mRNA 발현에 가장 강력한 억제 효과를 나타냈다. DMF 12.5 μM 의 용량에서만 억제하였고, PMF 와 Quercetin 은 TNF-α 로 자극된 HDFs 에서 MMP-1 의 mRNA 발현에 미치는 영향을 억제하지 않았다. 모든 샘플은 6.25 및 12.5 μM 두가지 농도 모두에서 MMP-1 분비를 유의하게 감소시켰다. 그 중 MMP-1 분비를 억제하는 데 가장 효과적인 화합물은 DMF 였다. COLIA1 의 mRNA 발현 및 분비를 분석한 결과 TMF 만이 6.25 μM 에서 COLIA1 수치 회복에 긍정적인 효과를 보였다. 또한 TMF 처리는 6.25 및 12.5 μM 두가지 농도 모두에서 COLIA1 분비를 유의하게 회복시켰다.
실험하였던 5 가지 마커에 대한 DMF, TMF, PMF 및 Quercetin(positive control)의 효율성 비교를 위한 스파이더 차트를 통하여 본 실험에서 TMF 가 TNF-α-유도 섬유아세포 손상을 예방하는데 가장 강력한 잠재력을 보여주었다는 것을 분명히 나타낸다는 결론을 얻을 수 있었다.