Chapter 1. A qRT-PCR method capable of quantifying specific microorganisms compared to NGS-based metagenome profiling data
인체, 특히 위장관에 서식하는 미생물의 다양성과 구성을 분석하기 위해 널리 사용되는 기술인 차세대 염기서열 분석(NGS)을 이용한 메타지놈 프로파일링 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특정 미생물에 대한 정량 및 진단 기술에 대한 관심이 높아지고 있다. 최근 동향에 따르면, 실시간 유전자 증폭 정량기법 (qRT-PCR)은 NGS 기술의 높은 분석 비용과 시간 부담으로 인해 인간의 구강 및 비강과 관련된 박테리아를 검출하고 정량화하는 데 여전히 상당한 기술이다. 여기서는 100개의 분변 유래 장내 미생물 시료를 활용하여 생산된 NGS 메타지놈 프로파일링 데이터를 기반으로 qRT-PCR 분석을 통해 동일한 메타지놈 DNA 샘플 내의 5개 박테리아 속(Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Phascolarctobacterium, 그리고 Roseburia)의 식별 및 정량화를 위한 비교 분석을 병행했다. qRT-PCR 분석을 위해 각 속의 특정 유전자를 대상으로 하는 속- 특이적 프라이머 세트는 메타지놈 프로파일링 데이터와 통계적으로 일관된 정량 패턴을 도출하는 것을 허용했다. 또한, 생어 염기서열 판독 검증을 통한 세균 식별 결과는 각 프라이머 세트의 높은 유전자 증폭 특이성을 입증했다. 따라서, 본 연구는 qRT-PCR 방법을 적용하여 특정 미생물을 정량화 하는 접근 방식이 NGS의 잠재적 문제를 보완하는 동시에 다양한 미생물 진단 산업에 효율적인 혜택을 제공할 수 있음을 시사한다.
Chapter 2. Understanding the bacterial compositional network associations between oral and gut microbiome within healthy Koreans
구강 미생물 생태계는 장 질환에 영향을 미칠 수 있지만, 구강과 장내 시스템 간의 미생물 구성의 연관성을 입증하는 연구는 부족하다. 따라서, 우리는 112 명의 건강한 한국인 피험자로부터 채취한 타액과 대변 샘플로부터 장내 미생물 타입과 관련된 구강 내 세균 조성 네트워크를 조사하는 것을 목표로 했다. 여기서, 우리는 각 피험자로부터 채취한 타액과 대변 샘플로부터 세균 16S 앰플리콘 염기서열 판독을 수행했다. 그리고 나서, 우리는 다양한 비교통계법을 사용하여 건강한 한국인 성인을 대상으로 개인의 장내 미생물 타입과 관련된 구강 마이크로바이옴 타입을 결정했다. 타액 샘플 내 세균 구성간 상호작용 예측을 위해 Co-occurrence 분석을 수행했다. 그 결과, 구강 세균의 분포와 상대적 빈도수간 유의한 차이에 따라 2 개의 한국인 구강 마이크로바이옴 유형 (KO)과 4 개의 구강-장 관련 마이크로바이옴 유형 (KOGA)을 분류했다. 타액 샘플 내 우세한 상대 빈도로 분류된 Streptococcus 와 Haemophilus 속은 2 개의 KO 유형을 구별하는 데 결정적인 역할을 했다. 각 KO 유형의 피험자 내 장내 마이크로바이옴을 확인한 결과, 한국인의 주요 장내 미생물 타입인 Bacteroides 와 Prevotella 속 우점형에 따라 구강 미생물 구성이 편광됨이 관찰되었다. Co-occurrence 분석은 정상인의 Streptococcus 와 Haemophilus 를 중심으로 연결된 다양한 정상 구강 세균총과 조성 네트워크를 보여주었다. 본 연구는 건강한 한국인에서 장내 마이크로바이옴과 관련된 구강 마이크로바이옴 타입을 확인하고 그 특성을 조사하는 최초의 접근법이다. 따라서, 본 연구의 결과가 건강한 사람과 구강 질환 환자 간 미생물 조성 차이를 식별하고 장내 미생물 환경과의 연관성 (구강-장 마이크로바이옴 축)을 연구하는 잠재적인 정상인 대조군으로서 참조 자료가 될 수 있음을 제안한다.
Chapter 3. Exploring oral bacterial compositional network in two oral disease groups using a convergent approach of NGS-molecular diagnostics
일반적으로 알려진 구강 질환의 대부분은 미생물 군집의 균형과 관련하여 설명되기 때문에 세균 조성 네트워크를 결정하기 위한 정확한 세균 분류는 필수적이다. 그러나 장내 마이크로바이옴에 비해 구강 관련 연구는 데이터 풀이 작고, 일반적인 16S rRNA 스크리닝 방법은 종 수준에서 복잡한 세균 조성을 식별하는 데 학명 오분류 문제가 있다. 본 연구는 공개된 한국인 특이적 정상인 구강 마이크로바이옴 데이터와의 비교를 통해 39명의 구강 질환자 (충치 26명 및 치주염 13명)의 타액 내 종 수준의 세균 조성 네트워크를 탐색하는 것을 목표로 한다. 여기서는 NGS 기반 세균 16S V3-V4 앰플리콘 염기서열 판독 기술의 기술적 한계를 보완하기 위해 qRT-PCR 및 생어 염기서열 판독법에 기반한 종합적 분자진단법을 적용했다. 속 수준의 세균 조성 프로파일링 결과, 각 구강질환군 내 다수 질산염 환원균의 상대적 빈도가 대조군에 비해 현저히 낮은 것으로 나타났다. 또한, 분자진단 기반 세균 동정법을 통해, 각 구강질환에 내 식별된 1차적 증식균(Streptococcus 및 Actinomyces unclassifcation)의 올바른 학명을 확인할 수 있었다. 마지막으로, 속 수준의 세균조성 확인 결과와 마찬가지로 각 구강질환군의 타액 내 분류된 많은 핵심 종들도 질산염 환원과 관련이 있었으며, 각 질환과 관련된 다양한 병원균들과 조성 네트워크를 형성했을 것으로 추정됐다. 본 연구는 NGS-분자 진단의 융합적 접근법을 사용하여 명확하지 않은 학명 분류로 인해 종 수준에서 정확한 세균 조성 네트워크를 식별하는 어려움을 보완할 수 있는 새로운 접근법을 소개한다. 궁극적으로, 본 연구의 실험적 접근 방식과 결과가 질산염 환원균에 대한 상대적 빈도 변화에 따라 세균 조성 네트워크 간의 상관 관계 및 구강 건강과의 연관성을 결정함으로써 구강 질병을 예방하려는 연구자들에게 잠재적인 참고 자료가 될 수 있음을 제안한다.