제브라피쉬의 신경 능선 세포는 배아의 초기 발달 과정에서 나타나는 전구체적 특성을 가지는 세포로, 말초신경계 외에도 여러 근골격계 세포로 분화한다는 특징을 가진다. 그렇기 때문에 초기의 신경 능선 세포들이 발달 과정에서 어떻게 분화하고 이동하는지를 밝혀내는 것은 척추동물의 초기 발달 과정 연구에 중요한 영향을 미친다. 이를 위해 본 연구에서는 TracerSeq라는 방법을 사용하여 초기 발생 단계의 세포 계통을 추적하고자 하였다. TracerSeq은 단일 세포 RNA 시퀀싱 기반의 방법으로, 전사된 무작위 바코드를 분석하여 세포의 계통을 추적한다. 이 바코드는 수정 직후 제브라피쉬 배아에 주입하여 Tol2 통합체 시스템을 통해 유전체에 통합되며, 각 통합 사건을 통해 세포 계통을 추적할 수 있습니다.
이전 연구에서는 동일한 발생 시점의 배아를 대상으로 TracerSeq을 수행했으며, 개체간의 세포를 구별할 수 있는 방법이 없었다. 그러나 이 연구에서는 각 개체를 구별할 수 있도록 라이브러리 ID를 도입하고 클로닝 효율을 최적화하는 방향으로 TracerSeq의 무작위 바코드 라이브러리를 구조적으로 발전시켰다. 또한, 바코드 통합의 효율성을 확인하기 위해 바코드가 주입된 배아에 대해 bulk cDNA를 대상으로 Nanopore 시퀀싱을 수행했다.
또한, 이전 연구와 가장 큰 차이점으로 특정 장기 또는 계통을 대상으로 한 효과적인 세포 계통 추적을 위해 형질 전환된 제브라피쉬 라인에서 TracerSeq을 활용하는 새로운 아이디어를 제안했다. Sox10:Gal4와 UAS:EGFP 유전자를 발현하는 이 형질 전환 제브라피쉬 라인은 초기 신경 능선 세포에서 강한 녹색 형광을 나타낸다. 무작위 바코드를 이 제브라피쉬 배아에 주입한 후 무작위 바코드가 유전자에 삽입되었음을 붉은색 형광 발현을 통해 확인하였다. 바코드가 도입된 이 Sox10:Gal4;UAS:EGFP 제브라피쉬 중 다양한 발생 단계의 8개 배아를 수집하고 단일 세포 수준으로 분해하였다. 이 세포들의 FACS sorting으로 바코드가 유전체에 통합된 신경 능선 세포인 이중 형광 발현 세포를 수집하였다.
단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행하기에는 모아진 세포 수가 충분하지 않았지만, sorting으로 얻은 세포들에서의 qPCR 분석은 신경 능선 표지자의 발현을 확인하였다. 이를 통해 앞으로의 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통한 바코드 계통 추적의 가능성을 엿볼 수 있었다.