암은 전 세계적으로 여전히 높은 사망률에 기여하고 있는 질병으로서, 암에 대한 치료는 종양 조직의 프로파일링에 의존하고 있다. 일반적으로, 치료의 단서가 될 종양 조직을 얻기 위해서는 환자의 건강 상태와 종양의 접근성을 고려해야 하는데, 일부 환자는 종양의 위치상 접근이 용이하지 않아 조직의 확보가 어려운 것으로 알려져 있다. 그리고, 종양은 클론진화로 인해 발생한 종양 내 이질성의 성향을 띄고 있기 때문에 FFPE section처럼 종양 조직의 일부만을 포함하는 검체에는 치료의 실마리가 될 클론이 포함되지 않을 가능성이 있고, 이로 인해 치료의 단서를 놓치는 결과로 이어질 수 있다. 또한, 암으로 진단받은 환자는 종양의 진행과 재발 및 치료의 반응성을 추적하기 위해서 주기적인 모니터링이 필요하다. 그러나 때마다 반복적인 조직의 채취는 쉽지 않음은 물론 영상학적인 테크닉을 통해 암의 관리가 가능하기는 하지만 비용적인 문제 및 초기단계의 종양이나 매우 작은 전이성 종양의 발견은 여전히 어려운 것으로 알려져 있다.
이러한 조직 수집 및 종양 내 이질성에 대한 문제를 극복할 대안으로서 액체 생검이 최근 급부상하고 있다. 하지만 액체 생검의 가장 큰 한계는 종양 유래의 DNA가 매우 낮은 농도로 존재하기 때문에, 이를 탐지할 수준의 초고감도 기법 개발이 필요하다. 실제 암 환자의 혈액 내 ctDNA의 비율은 0.1% 수준의 매우 낮은 농도부터 90%까지 다양한 것으로 알려져 있다. ctDNA 농도는 암종, 종양의 크기 및 위치, 그리고 치료의 반응성과 같은 다양한 요인이 복합적으로 작용하여 영향을 미친다. 그러므로 low-coverage sequencing이나 Sanger sequencing과 같은 저감도 검출 한계를 가진 테크닉을 사용하여, ctDNA의 비율이 낮은 검체로부터 질병의 진단 및 예후에 활용되는 변이를 검출하는 것은 적합하지 않다.
본 연구는 기존 MassARRAY 플랫폼에 AMRS primer를 추가하여 유전자 변이의 검출 감도를 높인 OncoUHS assay를 활용하고자 하였고, 비소세포폐암 환자에서 빈번하게 발생하는 유전자 변이를 선별한 후 Ultra-High Sensitivity Lung Version 1 (ULV1) panel을 디자인하고, 이를 1년 이상 장기 보관된 혈장을 이용하여 ctDNA 비율이 낮은 검체에서도 유전자 변이를 검출할 수 있는 수준의 검사법임을 확인하고자 하였다.
우리는 먼저 비소세포폐암의 진단, 치료의 반응성 및 예후를 예측할 수 있는데 중요한 역할을 하는 BRAF, KRAS, EGFR 유전자에 한하여 hotspot mutations 선정하였고, Multiplexing 적용이 가능한 MassARRAY의 이점을 이용하여 선정된 14 hotspot mutations을 2개의 pool로 나누고, 고감도 검출을 위해 반드시 필요한 Mutant-specific primer (MSP) 및 Primer set, 그리고 Unextended extend primer (UEP)를 디자인하고 이를 Ultra-high sensitivity lung version 1 (ULV1)으로 명명하였다. ULV1 panel의 target site를 포함한 target region의 증폭을 극대화하기 위해, Primers와 MgCl₂ 농도의 변화를 주어 최적의 농도 조건으로 최적화 한 후 표준 물질, cell lines 유래의 gDNA 및 hotspot을 포함하는 plasmid를 구축한 다음 이들을 단계별로 희석하여 다양한 농도의 샘플로 만든 후 ULV1 panel의 성능을 평가하였고, 그 결과 80 - 100%의 민감도와 87.9 - 100%의 특이도 그리고 0.025 - 0.1% 수준의 LOD를 확인하였다.
다음으로 ULV1 panel을 이용하여 진단의 정확성을 확인하고자, 장기간 보관된 104명의 소세포폐암 환자로부터 얻은 혈장 1 mL에서 cfDNA를 추출하고 이를 Adapter-ligated DNA library 형태로 제작하여 ULV1과 CT-ULTRA 실험에 사용하였다. 104명의 환자는 다양한 테크닉을 통해 종양 조직에서의 EGFR mutational status가 이미 확인된 sample cohort로 이 결과를 EGFR 진단의 정답지로 간주하고, 앞서 library 형태로 구축한 cfDNA를 사용하여 ULV1과 CT-ULTRA에서 확인된 EGFR mutation의 결과를 각각 비교 분석하였다. 그 결과 Stage II - IV에서 CT-ULTRA에 비해 더 나은 mutational concordance를 확인하였다.
또한, 단계별로 희석된 양성 샘플들을 이용하여 enrichment performance를 확인하고 특정 구간에서의 linearity phase가 확인됨으로써, 1% 이하의 낮은 mutant allele frequency를 가진 검체의 대략적인 ctDNA fraction을 유추할 수 있을 뿐만 아니라 낮은 수준에서의 ctDNA fluctuation을 파악할 수 있는 Semi-quantitative analysis의 가능성도 확인되었다.
마지막으로, 상용화된 PANAMutyper R EGFR kit와 ULV1 panel과의 성능을 직접적으로 비교함으로써 유사제품의 성능에 못지 않은 효율성을 확인하였다. 종합해 보면, ULV1 panel은 비소세포폐암 환자의 혈장 검체를 이용하여 유전자 변이를 식별하는데 유용할 수 있으며, 이를 통해 치료의 반응성을 낮은 수준에서도 모니터링 할 수 있을 뿐만 아니라 NGS data의 validation에도 활용될 수 있는 tool로써 이용 가능성을 제시한다.