표제지
초록
도표 및 약어 목록
목차
서론 12
1. 알츠하이머병의 병리와 판별 12
2. Aβ와 타우 간 상호작용과 "Aβ- Tau axis" 13
3. Aβ- Tau axis 구성요소로서 plexin-A4 15
4. AD에서 교세포 염증활성 및 독성 반응 17
5. 이소성-DNA 선천면역반응과 알츠하이머병의 관련성 19
6. cGAS-STING 면역경로의 분자기전 20
실험 재료 및 방법 27
Part 1. Aβ-타우 축의 매개체로서 plexin-A4의 기능 연구 27
1. 실험 동물 모델 및 수술 27
2. 일차 뉴런 배양 (primary neuron culture) 28
3. Plexin-A4 발현 억제용 아데노연관바이러스(AAV) 제작, 주입 28
4. 세포 배양 29
5. 유전자 발현용 플라스미드 제작 및 형질 주입 29
7. Aβ-, 타우- 결합 침강 분석 (pull-down assay) 31
8. 세포표면 바이오틴화 분석(cell surface biotinylation assay) 32
9. 세포-기반 Aβo 결합 분석 실험 32
10. 타우-이분자 형광상보기법 (Tau-Bimolecular fluorescence complementation; BiFC) 33
11. 쥐 뇌조직 시료 채취 33
12. 단백질 전기영동 및 웨스턴 블랏 (SDS-PAGE & WB) 34
13. 면역침강분석 35
14. 세포막분획 단백질추출 (Plasma membrane protein extraction) 35
15. RNA 추출 및 정량 역전사 연쇄중합효소반응 (qRT-PCR) 35
16. 면역형광염색 (Immunofluorescence staining) 36
17. Y형 미로 행동실험 (Y-maze test) 37
18. 데이터 정량 및 통계분석 37
Part 2. 알츠하이머병에서 이소성-DNA 감지 면역경로인 cGAS-STING경로 활성이 유도하는 미세아교세포의 형질변화 연구 38
1. 유전자 변형 쥐 모델 및 처치 38
2. 미세아교세포 배양 38
3. 성상교세포 및 뉴런 배양 39
4. 베타-아밀로이드 (Aβ) 펩타이드 전처리 39
5. 미세아교세포 자극과 약물 처리 39
6. 인간 유도만능줄기세포 (iPSC) 배양 및 CRISPR-기반 인간 STING 유전자 TMEM173 녹아웃 iPSC 세포주 구축, 미세아교세포 분화 40
7. 뇌혈관장벽 (Blood-Brain-Barrier; BBB) 투과성 시뮬레이션 41
8. AppNL-G-F/hTau-dKI 모델 쥐에 대한 STING 억제제 투여 및 뇌조직 채취 후 샘플화[이미지참조] 41
9. 성체 미세아교세포 분리 (Adult microglia isolation) 42
10. RNA 추출 및 정량 역전사 연쇄중합효소반응 43
11. 단백질 전기영동 및 웨스턴 블랏 43
12. Aβ 분획화 (fractionation) 및 효소면역측정법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA) 44
13. cGAMP 효소면역측정법 45
14. 세포분획화 및 세포기질 내 ectopic-DNA 측정 45
15. 면역형광 염색 46
16. Y-미로 행동실험 47
17. 사물인식 실험 (Novel objective recognition test; NOR) 47
18. 데이터 정량 및 통계분석 47
결과 49
Part 1. Aβ-타우 축의 매개체로서 plexin-A4의 기능 연구 49
1. Plexin-A4, NRP-2 복합체가 Aβ수용체로서 결합력을 가짐 49
2. Plexin-A4와 NRP-2가 알츠하이머 모델 쥐의 뇌에서 위치상으로 겹쳐 나타남 52
3. Aβ는 뉴런 원형질막에 위치한 plexin-A4 양을 증가시킴 53
4. Plexin-A4 isoform 1 (TS1)만이 total tau와 p-tau양을 농도-의존적으로 증가시킴 54
5. Plexin-A4의 발현을 억제하는 경우 Aβ에 의한 키나아제 활성과 타우 인산화가 방지됨 56
6. Plexin-A4의 발현 억제로 알츠하이머 모델 쥐에서 인지기능 저하와 타우 병증이 완화됨 58
Part 2. 알츠하이머병에서 이소성-DNA 감지 면역경로인 cGAS-STING 경로 활성이 유도하는 미세아교세포의 형질변화 연구 61
1. cGAS-STING 면역경로가 다양한 알츠하이머병 모델에서 활성화되어 있음 61
2. STING이 Aβ와 tau에 의한 미세아교세포의 염증성 반응과 제 1형 인터페론 반응 유도의 주요 인자임 64
3. STING을 억제할 경우 알츠하이머병 쥐 모델인 AppNL-G-F/hTau 쥐에서 신경염증과 교세포 활성이 감소됨.[이미지참조] 68
4. AppNL-G-F/hTau 쥐에서 미세아교세포의 제1형 인터페론 반응이 cGAS-STING 경로에 의해 조절됨[이미지참조] 70
5. STING 억제의 결과로 AppNL-G-F/hTau 쥐에서 Aβ와 tau 병증이 완화됨[이미지참조] 71
6. STING 억제시 AppNL-G-F/hTau 쥐의 인지기억능 감소와 비정상적인 시냅스 포식현상이 방지됨[이미지참조] 72
고찰 99
1. Aβ-Tau axis 연구에 있어 AD모델 연령대 선택 및 타우병증의 평가 측면 99
2. Plexin-A4의 정상생리기능과 AD 상황에서 병리기능의 비교 101
3. 잠재적인 Plexin-A4 하위 신호와 타우 변성기전에 대한 고찰 105
4. 본 plexin-A4 연구가 갖는 한계점 106
5. AD병증에 ectopic-DNA감지 면역경로 활성이 가지는 기여도 108
6. 미세아교세포의 인터페론성 형질 분화 유도인자로서 cGAS-STING 경로의 기능 시사 110
7. 시냅스 소실 및 타우 변성과 미세아교세포 cGAS-STING 경로 활성 사이의 밀접성 111
8. 다양한 생물학적 맥락에서 공통적으로 나타나는 cGAS-STING 경로 활성이 가지는 함의에 대한 고찰 113
결론 117
참고 문헌 119
Abstract 132
표 1. Part 1 연구에 사용된 primer 서열 정보 98
그림 1. 노화와 알츠하이머병 (AD) 상황에서의 중추신경계 세포들의 복합적인 상호작용. 22
그림 2. 알츠하이머병에서 베타-아밀로이드 병증과 타우 병증의 발달 및 제거 과정과 시간순서 개략도 23
그림 3. 타우가 베타-아밀로이드의 신경독성 및 퇴행을 매개하는 주요 요소임을 보여주는 베타-아밀로이드-타우 축의 개념도. 24
그림 4. 알츠하이머 모델 쥐인 AD-like-pathology (ADLP) 쥐와 Knock-in 쥐의 그룹 구성에 대한 개략도 25
그림 5. cGAS-STING 선천면역경로의 활성 및 신호전달체계 모식도 26
그림 6. Aβ수용체로서의 Plexin-A4 /NRP-2복합체 형성. 75
그림 7. Plexin-A4와 NRP-2의 개별 결합성, 발현 세포주 분석 결과 및 사용된 Aβ의 응집 상태 검증 결과. 76
그림 8. Plexin-A4와 NRP-2 간 결합성 확인 및 Aβ에 의한 세포 표면 plexin-A4의 양적 증가. 77
그림 9. Plexin-A4와 Aβo 간 위치 겹침과 원형질막상 결합 조건 분석. 78
그림 10. Plexin-A4 isoform 중 TS1에 국한된 타우 단백질 총량과 타우 인산화 (p-tau)의 농도-의존적 증가 양상. 79
그림 11. Plexin-A4-TS1의 타우, p-tau 증가 효과는 자가포식-리소좀 및 유비퀴틴-프로테아좀 분해경로에 독립적으로 나타남. 80
그림 12. Plexin-A4의 발현 억제에 의한 Aβ-유도 타우 키나아제 p35-CDK5의 활성과 타우 과인산화 및 응집의 억제. 81
그림 13. Plexin-A4 knockdown을 위한 아데노연관바이러스(AAV)의 독성 및 knockdown 효과 검증. 82
그림 14. ADLPAPT 쥐에서 plexin-A4 유전적 억제에 의한 공간작업기억 저하 방지와 Aβ에 의한 타우 병증 악화방지 효과.[이미지참조] 83
그림 15. ADPTau 쥐 대비 ADLPAPT 쥐에서 타우 키나아제의 활성도 차이 및 AAV 주사 대조지역 분석.[이미지참조] 84
그림 16. Part 1 연구의 결과 요약그림. AD에서 Aβ-Tau 축의 매개인자인 Plexin-A4를 발굴함. Plexin-A4는... 85
그림 17. 다수의 알츠하이머병 모델에서 검출되는 cGAS-STING 선천면역경로의 활성 및 증대. 86
그림 18. 두 독립적인 Aβ 병증 쥐 모델에서 DNA 손상 마커 rH2AX의 증가에 선행해 나타나는 cGAS와 STING 단백질 증가 양상. 87
그림 19. 다양한 AD 모델 쥐에서 검출되는 뇌 Aβ 플라크 내 핵산, dsDNA 염색신호양상. 88
그림 20. 미세아교세포에서 Aβ와 타우에 의한 미토콘드리아 형태적 변화 및 세포기질 내 ectopic-DNA 증가와 STING 활성조절에 따른... 89
그림 21. Aβ와 타우의 구별되는 cGAS-STING 하위 신호경로 활성화 패턴 및 자가포식-리소좀 분해경로의 억제에 의한 STING의 신호전달... 90
그림 22. cGAS-STING 경로의 작용제와 길항제의 뇌혈관장벽 (BBB) 투과도 예측 시뮬레이션 결과. 91
그림 23. AppNL-G-F/hTau-dKI 쥐에서 STING 억제제 H-151 투여에 따른 뇌조직의 STING의 양적 변화 및 쥐 몸무게 변화.[이미지참조] 92
그림 24. STING 억제제 H-151 투여 실험 개략도 및 STING 억제에 의한 AppNL-G-F/hTau-dKI쥐의 염증성 사이토카인, 보체, NLRP3...[이미지참조] 93
그림 25. AppNL-G-F/hTau-dKI 쥐에서 STING 억제에 의한 Aβ 병증과 타우 병증의 개선 효과.[이미지참조] 94
그림 26. STING 억제로 인한 APPNL-G-F/hTau-dKI 쥐의 미세아교세포 p-STAT1 감소 및 뉴런에서 cGAMP 처리에 의한 인터페론 반응성...[이미지참조] 95
그림 27. STING 억제제가 투여된 AppNL-G-F/hTau-dKI 쥐에서 보이는 인지·기억능력의 개선 및 미세아교세포의 비정상 시냅스 포식작용의...[이미지참조] 96
그림 28. Part 2 연구 내용의 요약그림, 알츠하이머병의 병리요인들에 의해 미세아교세포 내 ectopic-DNA가... 97