본 연구에서는 생리학적 과정의 중요한 조절자인 단백 분해 효소인 HTRA(High temperature requirement A serine protease)의 다양한 생화학적 경로를 확인 탐색하고자 이를 타겟으로 하는 형광 기질 및 cyclic probe를 합성하였다.
첫째, HTRA를 타겟으로 하는 형광 기질을 합성하였다. 이전 연구에서 HTRA1, HTRA2 및 DegP를 포함한 HTRA 계열의 단백질 가수 분해 효소를 선택적으로 표적화하는 활성 기반 프로브를 개발하였는데, 이번 연구에서는 기존의 프로브 peptide sequence를 참고하여 Fluorescent tags 였던 fluorescein 대신 coumarin derivative인 7-Amino-4-methylcoumarin을 부착하여 기존의 HTRA의 활성 측정을 위한 substrate로 사용되고 있는 시판중인 기질인 H2-OTP에 비해 분자량이 작은 형광 기질을 합성하고 에세이를 통해 효소-기질 반응을 관찰하였다.
둘째, neuroblastoma cell line인 SK-N-SH와 SH-SY5Y에서 ATRA 처리를 통해 neuron-like 세포로 분화 시킨 뒤 두 세포에서의 HTRA의 수준 변화를 HTRA계열의 단백질 가수 분해 효소를 선택적으로 표지하는 2세대 형광 프로브를 이용하여 SDS-PAGE와 광학영상을 통해 관찰하였다.
셋째, HTRA를 타겟으로 하는 cyclic activity-based probe를 합성하였다. 이전 연구에서는 최적화를 위해 비천연 아미노산을 포함하였고 이 프로브는 질량이 작아 세포 투과도가 높고 선택성이 우수하나 단백질이 고농도로 농축된 시료의 경우 혈장단백질과의 비특이적 반응이 관찰되었다. Cyclodepsipeptide는 serine protease에 강력한 억제 특성을 나타내는 펩티드 종류이며 이러한 구조를 기반으로 한 강력한 HTRA 저해제가 보고된 바 있어 이와 유사한 구조의 cyclic probe를 합성하여 감도와 안정성을 높이고자 하였다.