본 연구는 모유에서 분리한 Lacticaseibacillus rhamnosus HMP013 및 HMP014의 프로바이오틱스 특성, 대장 상피 세포 및 세균성 질염에 대한 보호 효과를 평가하는 것을 목적으로 하였다.
항균활성을 갖는 모유 유래 유산균을 선별한 후, 프로바이오틱스 특성 및 장 상피 세포에서의 세포독성, 항생제 감수성, 용혈시험을 통해 안전성을 평가하였다. 선별된 L. rhamnosus HMP013 및 HMP014는 Staphylococcus spp., Escherichia spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Klebsiella spp. 및 Enterobacter spp.를 포함하는 Gram 양성 및 Gram 음성균에 대해 항균 활성을 나타냈다.
산성 및 담즙산염 조건에서 두 균주 모두 우수한 생존율을 보였으며, 프로바이오틱스의 장내 부착 및 집락화에 중요한 인자인 자가응집력 및 세포표면 소수성을 평가한 결과, 높은 수준의 자가응집력 및 세포표면 소수성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 in vitro 상에서 장 상피 세포에 대한 부착능은 두 균주 모두 50% 이상의 접착 능력을 보였으며, 장 상피 세포에 대한 세포독성 및 용혈성은 없는 것으로 확인되었다. 항생제 내성평가에서는 L. rhamnosus HMP013 및 HMP014 모두 ampicillin, tetracycline 및 erythromycin에 대해서는 내성이 없었으나, kanamycin과 streptomycin에 대해서는 내성을 보였다. 따라서 kanamycin 및 streptomycin에 대한 내성 유전자 분석 등 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
대장 상피 세포에 대한 보호 효과를 확인하기 위해, lipopolysaccharide(LPS)로 자극된 장 상피 세포에서 염증성 사이토카인(IL-8 및 IFN-γ), 항염증성 사이토카인(IL-10 및 IFN-α), COX-1 및 COX-2 mRNA 발현과 장내 장벽기능의 유지와 보호에 관여하는 MUC2 및 HSP70 mRNA의 발현을 분석하였다. L. rhamnosus HMP013 및 HMP014의 배양액, 생균 및 사균체를 각각 처리하여 분석한 결과, 염증 유발 사이토카인인 IL-8과 IFN-γ mRNA의 발현이 대조군에 비해, 생균 처리 시 유의하게 감소하였고, 항염증성 사이토카인인 IL-10과 IFN-α mRNA의 발현은 증가하였다. COX-1 mRNA의 발현량은 대조군에 비해, 생균 처리 시 유의하게 증가하였고, 반대로 COX-2 mRNA의 발현은 생균 처리 시, 유의한 감소를 보였다.
또한, 장내 장벽기능의 유지 및 보호 효과와 관련된 HSP70 및 MUC2 mRNA 조절을 확인하였다. 정상세포에 비해, LPS를 처리한 세포군은 LPS 유도로 인한 스트레스로 인해 HSP70 mRNA 발현이 증가하였고, L. rhamnosus HMP013 및 HMP014를 처리하였을 때, HSP70 mRNA 발현이 LPS 처리한 세포군에 비해 현저히 감소하였다. 이는 세포가 LPS에 의해 스트레스에 노출되었지만, L. rhamnosus HMP013 및 HMP014를 동시 처리하여 LPS에 의한 스트레스 수준이 하향조절되어 상대적으로 낮은 수준의 HSP70 mRNA 발현량이 나타난 것으로 보인다. MUC2 mRNA의 발현량의 경우 사균체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 유의하게 증가한 것으로 확인되었는데, 이러한 결과는 세포벽 성분과 세포 내 물질이 포함된 사균체가 장내 장벽기능의 유지 및 보호에 기여할 수 있는 것으로 판단된다.
또한, 유익한 프로바이오틱스로써 여성 질 건강 및 세균성 질염 예방의 가능성을 확인하기 위해, L. rhamnosus HMP013 및 HMP014의 항염증 및 항균 효과를 확인하였다. Nitric oxide (NO)는 감염성 유기체에서 세포독성 및 조직손상 등을 유발할 수 있어 염증 매개체로 중요한 인자로 작용하며, 감염성 질염이 있는 환자는 정상인에 비해 약 100배 이상의 높은 NO 수치를 보이는 것으로 나타나, 이에 대한 연구가 필요하다. 따라서, 항염증 효능을 확인하기 위해 LPS로 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성 억제 및 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량을 평가하였다. 그 결과, 배양액, 생균 및 사균체를 처리하였을 때, NO 생성이 유의하게 억제되었다. 또한 LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량을 측정한 결과, TNF-α, iNOS, COX-2, IL-6 및 IL-1β의 발현량이 현저히 감소하여 면역조절 효과가 있는 것으로 나타났다. 특히, TNF-α 및 iNOS mRNA 수준의 감소는 사균체에서 가장 우수하게 나타났으며, COX-2, IL-6 및 IL-1β는 생균에서 유의한 감소가 나타났다.
또한, L. rhamnosus HMP013 및 HMP014의 배양액은 DPPH 및 ABTS radical 소거능의 경우 80% 이상, superoxide dismutase(SOD)-like activity의 경우 54% 이상의 수준을 보여, 이는 두 균주 모두 항산화 효능을 가지는 물질을 생산할 수 있는 것으로 판단된다.
항균 물질을 포함한 대사산물인 L. rhamnosus HMP013 및 HMP014의 배양액은 특히, 피부 상재균인 Staphylococcus epidermidis, 질염을 유발하는 Gardnerella vaginalis 및 Candida albicans 뿐만 아니라 다제내성 균에 대해서도 항균효과를 보였다. 이와 같은 결과는 균주에 의해 생산된 항균물질이 광범위한 항균 스펙트럼을 가지는 것으로 판단되며, 최근 질염 증상을 겪는 환자에게서 항생제 내성균의 검출이 증가하고 있는 문제를 해결하기 위한 중요한 공급원 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.
질 내 환경에서 유산균은 젖산, 과산화수소 및 박테리오신과 같은 항균물질을 생산하여 병원체에 대한 감염을 예방하기 때문에, RP-HPLC 분석을 통해 배양액 내 L. rhamnosus HMP013 및 HMP014가 생산하는 젖산을 정량분석하고, 펩타이드 분석을 통해 박테리오신 유사 물질을 생산하는 것을 확인하였다. 특히, 펩타이드 분석을 통해 검출된 박테리오신 유사 물질을 분획하여 항균 활성을 확인한 결과, Gram 양성 및 Gram 음성균에서 모두 항균효과가 나타나, 젖산 외에 박테리오신 유사 물질을 생산할 수 있음을 입증하였다. 특히, 주사전자현미경을 통한 S. epidermidis NCTC 11047과 G. vaginalis KCTC 5096의 형태학적 변화를 확인하여 L. rhamnosus HMP013과 HMP014의 배양액 처리에 의한 세포벽 파괴를 확인하였다.
이와 같은 연구 결과를 바탕으로 L. rhamnosus HMP013 및 HMP014는 프로바이오틱스로써 LPS로 자극된 인간 대장 상피 세포에 대한 보호효과 뿐만 아니라, 질염 유발균 및 다제내성 균에 의한 감염을 억제할 수 있는 우수한 잠재력을 가지며, 그 가치가 우수할 것으로 기대된다.