당근(Daucus carota)은 carotenoid 생합성 관련 유전자의 발현수준에 따라서 근색에 차이를 보이며, 다른 작물에서 genome editing을 이용하여 관련 유전자를 knockout 시켜 lycopene의 축적이 증가되었다는 보고가 이루어진 바 있다. 본 연구는 주황색 당근에 CRISPR/Cas9 매개 genome editing을 이용한 carotenoid 생합성 관련 유전자의 편집을 통해 홍색 변이체를 개발하고자 하였다. 본 연구에서는 Kuroda type 당근 inbred line 2계통(19-1218, 19-1254)의 종자를 기내 발아시켜 얻어진 배축 절편체를 Agrobacterium-매개 형질전환에 사용하였다. SpCas9과 선발마커 nptII를 포함하고 있는 pKAtC에 DcSGRL, DcLCYB1, DcLCYB2 와 DcLCYE을 표적하는 11개의 sgRNA의 염기서열 중 하나를 삽입하여 제작한 11종의 vector를 각각 도입한 Agrobacterium tumefaciens LBA4404을 사용하여 당근 배축 절편체를 형질전환 시켰다. 형질전환된 절편체로부터의 식물체 재생 과정에서 사용한 모든 배지는 MSB5배지(MS salts & B5 vitamins)를 사용하였고 선발배지에는 kanamycin 25-50mg/L, cefotaxime 250mg/L를 첨가하여 사용하였다. 접종한 절편체를 2-3일간 공조배양한 후, TCIM배지(2,4-D 0.2mg/L)에서 8-12주간 배양하였을 때 callus가 형성되었다. 절편체로부터 callus를 분리하고 TEM배지에서 4주간 배양하고 동일한 배지에 계대배양하여 4주간 배양하여 체세포배를 형성시켰다. 이후 체세포배의 발아를 통해 소식물체가 형성되었으며, 소식물체는 cefotaxime이 제거된 TPM배지에서 신장시켰다. Inbred line 19-1218에서 callus 형성률은 DcSGRL에서 10.2%, DcLCYB1에서는 8.8%, DcLCYB2는 15.0%, DcLCYE는 18.9%으로 나타났고, 재생률은 DcSGRL에서 1.3%, DcLCYB1와 DcLCYB2에서 각각 8.8%와 2.5%, DcLCYE에서 3.5%로 나타났다. Inbred line 19-1254에서 callus 형성률은 DcSGRL에서 19.8%, DcLCYB1에서는 19.2%, DcLCYB2는 29.6%, DcLCYE는 26.6%으로 나타났고, 재생률은 DcSGRL에서 5.3%, DcLCYB1에서 1.2%, DcLCYB2에서 3.0%, DcLCYE에서는 4.5%를 보였다. Inbred line 19-1218과 19-1254에서 각각 형질전환체로 추정되는 식물체 59개와 172개를 대상으로 Cas9과 nptII 프라이머를 이용한 PCR 분석을 통해 각각 19-1218에서는 58개, 19-1254에서는 154개의 식물체에서 460bp와 579bp 크기의 예상했던 band를 확인하였다. 유전자 도입이 확인된 식물체 111개를 대상으로 target gene에 특이적인 primer을 이용하여 Sanger sequencing을 수행하였을 때 16개 식물체(14.4%)에서 염기의 indel을 확인할 수 있었으며, 표적 유전자와 sgRNA에 따라 mutation 효율과 mutated type이 다르게 나타났다. Mutation 비율은 sgRNA47에서 46.7%로 제일 높았으며, 다음으로 3개 gRNA에서 16.6%-10.7%로 나타났다. DcSGRL을 표적으로 편집한 식물체 가운데 sgRNA33에서 inbred line 19-1218에서 1계통, 19-1254에서 1계통에서 1-3개의 염기의 결실을 확인하였으며 heterozygous의 genotype을 보였다. sgRNA34로 편집된 mutated plants는 inbred line 19-1254의 3계통 모두 5-29개의 염기가 결실되었으며 homozygous genotype을 보였다. 또한, DcLCYB2를 표적으로 편집한 식물체에서 DcLCYB2 sgRNA45은 inbred line 19-1254에서 4개의 계통에서 1-5개의 염기의 결실이 발생하여 bi-allelic, heterozygous의 genotype을 보였다. DcLCYB2 sgRNA47에서는 inbred line 19-1218은 1개의 계통과 inbred line 19-1254은 6개의 계통에서 동일한 위치에서 indel이 보였는데, 최대 19개의 염기의 결실, 1개의 A, T의 삽입되어 bi-allelic genotype을 보였다. 이후, 형질전환체를 기외활착 시킨 후 온실에서 재배 중이며, 표적 유전자의 염기서열 변화를 확인한 mutation line의 근색 변경을 확인하고자 한다. 본 연구의 결과는 앞으로 당근에서 gene editing을 이용한 다양한 신품종 개발에 효과적으로 활용될 것으로 판단된다.