배경
FMS-like tyrosine kinase-3 (FLT3) 변이는 급성골수성백혈병의 약 25%에서 발견되며, 불량한 예후 인자로 알려져 있다. FLT3 변이 급성골수성백혈병의 치료를 위해 다양한 tyrosine kinase inhibitor (TKI)가 개발되었으나, 단일 요법 효능은 2 차 FLT3 변이 및 대체 경로의 유전자 활성화로 인해 한계를 보인다. 이를 개선하기 위해서 새로운 조합의 치료 전략이 필요하다. Cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) 억제제는 발암 유전자의 전사 억제와 세포 주기를 전환시켜 암의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 급성골수성백혈병을 포함한 다양한 암종에서 항암 효과를 나타냄이 보고되었다. 본 연구는 FLT3 변이를 지닌 급성골수성백혈병 세포에서 CDK7 억제제인 YPN-005 와 FLT3-TKIs 의 병용 효능을 확인하고 FLT3 변이 급성골수성백혈병 치료를 위한 새로운 전략을 제시하고자 하였다.
실험방법
FLT3 변이 급성골수성백혈병에서의 효과 평가를 위해 인체유래 세포주(MV4-11, MOLM-13, MOLM-14, Ba/F3-ITD)와 환자 유래 일차세포를 이용하였다. YPN-005 와 FLT3-TKIs (Midostaurin, Quizartinib 또는 Gilteritinib)의 병용 처리에 따른 세포성장 억제 평가는 세포증식 억제 효능(CellTiter-Glo® assay kit) 및 병용 효과 예측 시스템(Calcusyn & Combenefit software), 군집 형성능(Colony forming units)을 이용하였다. 병용 처리에 따른 기전평가를 위하여 Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) 염색법을 이용하여 세포자가사멸능을 측정하였고, 세포사멸 유도인자인 PARP 와 caspase-3 단백 절단을 면역블롯 방법(immunoblotting assay)을 이용하여 측정하였다. 미토콘드리아의 기능 이상 유도는 tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) 염색 후 미토콘드리아 막 전위차를 측정하여 평가하였으며, 미토콘드리아의 형태 변화는 전자현미경으로 관찰하였다. 급성골수성백혈병 동소마우스 모델을 이용하여 병용 투여로 인한 생존율 증가 효능을 확인하였다.
실험결과
FLT3 변이 급성골수성백혈병 세포주와 급성골수성백혈병 환자 유래 일차세포에서 YPN-005 와 FLT3-TKIs (Midostaurin, Quizartinib 또는 Gilteritinib)를 단독 또는 병용 처리하여 세포성장 억제 효과를 확인하였다. FLT3 변이 급성골수성백혈병 세포주와 Ba/F3-ITD 세포주에서 단독 처리 대비 병용 처리에서 세포성장 억제가 유의하게 증가하였으며, 환자 유래 일차세포에서 병용 처리 시 우수한 세포성장 억제능을 확인하였다. 이러한 세포성장 억제 효능의 유의성 확인을 위해 병용 예측 시스템을 이용한 결과, FLT3 변이 급성골수성백혈병 세포주와 Ba/F3-ITD 세포주 간 YPN-005 와 FLT3-TKIs 의 두 약물 조합에 따른 차이는 있으나 전체적으로 상승 효과를 나타냈다. 세포성장 억제 기전 규명을 위해 수행된 Annexin V-FITC/PI 염색 결과, 양성세포의 비율이 단독 처리 대비 병용 처리에서 유의미하게 증가되었다. 더불어 세포 주기 억제 효과는 미미하였지만, 세포자가사멸 유도 단백인 PARP 와 caspase-3 의 절단에 따른 활성 유도가 병용 처리에서 세포자가사멸 유도가 우수함을 확인하였다. YPN-005 와 FLT3-TKIs 의 단독 처리 대비 병용 처리 시 미토콘드리아 막 전위 손실이 유의미하게 증가되었고, 미토콘드리아의 형태적 손상이 관찰되었다. 급성골수성백혈병 동소마우스 모델에 YPN-005 와 FLT3-TKI 인 Quizartinib 을 병용 투여한 그룹에서 단독 투여 대비하여 생존율이 향상되었고 생체 내 백혈병 세포증식 억제성이 증가되었다.
결론
YPN-005 와 FLT3-TKIs 의 병용 처리는 FLT3-ITD 변이 급성골수성백혈병의 시험관 내 모델에서 미토콘드리아 손상을 유도하여 자가세포사멸 및 암세포 성장 억제를 증가시켰다. 본 연구는 FLT3-ITD 급성골수성백혈병에서 CDK7 억제제(YPN-005)와 FLT3-TKIs 를 병용 처리 하는 것은 효과적인 치료 전략이 될 가능성이 있음을 제시한다.