자연계나 시장에서 방출된 산업용 genetically modified organisms(GMO) 모니터링과 추적 가능성을 보장하기 위해 유럽(EU)을 포함한 많은 국가에서 GMO 법률이 제정하였다. 최근 합성생물학의 급속한 발전으로 바이오의약품, 식품, 사료, 산업용 바이오안전 분야로 다양화되고 있다. 다라서 GMO관련 법안 집행은 복잡해지고 있다. 유전자 변형 미생물(GMM)인 생명공학의 발전으로 자연에 의도적 또는 의도하지 않은 방출의 위험이 증가한다. 본 연구에서는 기존 GMM 검출 시스템의 개선 및 개선을 목적으로 살아있는 형질전환 미생물의 정량적 검출을 위한 실시간 PCR 및 propidium monoazide(PMA) 처리 기법을 개발하였다.
전 세계적으로 개발된 산업용 LMM에 대한 개요를 수행하여 transgenic 카세트에서 발견되는 요소 정보를 수집하였다. 이 정보에 따르면, 광범위한 LMM을 검출하고 특성화할 수 있는 전략을 개발하기 위해 LMM 항생제 선택 마커 유전자(AmpR, KmR, CmR 및 Km2R)를 선택하였다. 형질전환 요소의 서열은 항생제 선별마커 검사 방법을 통해 검사된다.
산업용 LMM을 모니터링하기 위한 새로운 세포 직접 정량적 qPCR 방법을 개발, 최적화 및 광범위한 탐지를 위해 검증되었다. E. coli 및 C. glutamicum 분류 특이성인 dxs 및 dnaA의 게시된 플라스미드 및 게놈 데이터를 평가함으로써, 우리는 대장균의 두 분류별 고유 유전자인 dxs와 dnaA를 구별하는 서로 다른 레이블을 가진 범용 프라이머 세트와 한 쌍의 가수분해 프로브를 설계하기로 결정했다. 본연구에서 6종 LMM 균주가 분석 개발에 사용하였고, 그중에 플라스미드 삽입된 E. coli DH5α 균주는 3개, 1개의 genome변형된 K-12 균주, 그리고 플라스미드 삽입된 C. glutamicum ATCC13032 균주 2개인 것을 포함되었다.
qPCR 반응에서 프라이머 및 프로브 농도를 최적화하였다. 각각의 LMM에 대한 증폭 효율을 아래와 같이 확인하였다: E. coli AmpR 및 AmpR-dxs DNA 표준 곡선 효율은 각각 qPCR에 의해 102.0% 및 92.23%였다. E. coli KmR 및 KmR-dxs DNA 표준 곡선 효율은 qPCR에 의해 각각 92% 및 99.27%였다. E. coli CmR 및 CmR-dxs DNA 표준 곡선 효율은 qPCR에 의해 각각 110% 및 92.90%였다. E. coli Km2R 및 Km2R-dxs DNA 표준 곡선 효율은 qPCR에 의해 각각 101% 및 90.00%였다. C. glutamicum CmR 및 CmR-dnaA DNA 표준 곡선 효율은 qPCR에 의해 각각 110.0% 및 99.84%였다. C. glutamicum KmR 및 KmR-dnaA DNA 표준 곡선 효율은 qPCR에 의해 각각 110% 및 96.62%였다.
PMA 처리된 세포로 qPCR을 수행하여 E. coli 및 C. glutamicum에서 살아있는 세포를 검정하였다. 콜로니 형성 단위(CFU)로 PMA-qPCR의 평균 Cq 값으로부터 계산된 이론적 세포 밀도 및 실제 복제 수와 비교하여 bias% 및 RSD%를 계산하였고 실험의 진실성 및 정확성을 확인하였다. 실험 결과는 4개의 대장균주에 대해 7.71%(AmpR), 2.74%(KmR), 1.62%(CmR), 12.10%(Km2R)의 편차를, 2개의 C.glutamicum 균주에 대해 각각 21.49%(CmR), 48.94%(KmR)의 편차를 보였다. E.coli 균주 4개와 C. glutamicum 균주 1개는 GMO 실험실 유럽망(ENGL) 허용기준의 ±25% 이내에서 편향을 보였으나, C. glutamicum 균주 1개는 PMA-qPCR과 판계수 사이에서 큰 편향을 보여 Km-내성 C. glutamicum의 생존세포 모니터링을 위한 PMA-qPCR이 부적절한 것으로 나타났다. PMA-qPCR을 이용하여 항생제 내성 마커 유전자로 대장균과 C. glutamicum 및 이들의 분류군 특이 유전자 dxs와 dnaA를 검출하기 위해 95% 신뢰도(LOD95%)에서 실행 가능한 세포 검출 한계는 4개의 대장균주에 대해 134(AmpR), 69(KmR), 20(CmR), 67(Km2R), 2개의 C. glutamicum균주에 대한 45(CmR) 및 6403(KmR)을 결정되었다. DNA 기반 qPCR 방법과 비교하면, 세포 현탁액 직접 PMA-qPCR 분석은 신뢰할 수 있는 결과를 제공하며 잠재적으로 환경에 방출될 수 있는 LMM을 모니터링하는 빠르고 정확한 방법이다.