Background: Sulfated glycosaminoglycan(SuGAG)은 extracellular matrix(ECM)의 구성요소이며, 피부의 조직 발달 및 재생을 담당한다. 그중 하나인 heparin은 현재 의약품으로 사용되고 있으며, fibroblast growth factor(FGFs)와 epidermal growth factor(EGFs) 같은 단백질 활성화 기능과 결합하여 피부세포 증식을 조절하는 소재로도 사용되어 진다. 고분자 heparin을 화장품 원료로 사용하기 위해서는 고분자 heparin을 저분자화 하여 피부 침투 능력을 향상시키는 것이 필수적이다. Heparin을 분해하여 저분자화 시킬 수 있는 효소로 사용되는 Pedobacter heparinus 유래의 heparinase들은 기질 특이성에 따라 heparinase I, -II, -III로 분류되며, 본 연구에서는 heparinase I 및 III 유전자를 각각 Escherichia coli에 클로닝 하여 재조합 heparinase I 및 III 효소의 가용성 발현에 성공하였다.
Methods and results: E. coli에서 재조합 heparinase I(r-Hep I) 및 III (r-Hep III)의 발현을 위해 heparinase 유전자들을 pET28a 벡터에 클로닝하였다. 클로닝 균주는 E. coli DH5α, 재조합 단백질 생산을 위한 발현 균주로는 E. coli BL21(DE3)를 사용하였으며, IPTG 농도, 발현 시간(2, 4, 5, 6, 7, 8시간) 및 배양 온도(28, 30, 32, 35, 37℃)를 조절하여 가용성 발현을 유도하였다. 유도 후, 발현된 가용성 단백질을 Ni-IDA(iminodiacetic acid) 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하고, 정제된 단백질은 투석 과정에서 효소 활성 측정용 완충액으로 교체하였다. 정제 후 r-Hep I의 경우, 초음파 파쇄 후의 조효소가 2.3μmol/min/㎍의 활성이 나타났지만, 투석 후의 효소와 refolding 후의 효소에서 활성을 확인할 수 없었다. r-Hep III는 초음파 파쇄 후 조효소에서 1.4μmol/min/㎍, 투석 후 효소에서 3.6μmol/min/㎍의 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
Conclusion: r-Hep I과 r-Hep III의 활성도를 평가하기 위해 R&D system 사의 재조합 heparinase I(R&D r-Hep I) 및 III(R&D r-Hep III)를 대조군으로 하여 비교하였다. r-Hep I의 조효소는 R&D r-Hep I 효소 활성보다 약 1.5배 정도 높은 활성을 보였다. r-Hep III의 조효소는 R&D r-Hep III 효소 활성과 비슷했지만, 투석 후의 효소는 3.6배 정도 높은 활성을 확인하였다. 이는 재조합한 효소가 heparin 저분자화에 사용할 수 있음을 보여주고 있다. 추후 실험으로 저분자화 된 heparin이 화장품 소재로서의 가능성이 있음을 보여줄 수 있을 것으로 판단된다.