표제지
목차
ABSTRACT 9
I. 서론 11
(A) 류마티스 관절염 (Rheumaoid Arthritis)과 IK 단백질 11
(B) tIK 단백질에서 항염 활성을 갖는 펩타이드 도출 13
(C) tIK 펩타이드의 발현을 위한 벡터 디자인 18
II. 본론 20
A. 실험 과정 및 결과 20
(1) tIK series의 발현 20
(2) tIK series의 분리 및 정제 22
(3) 질량분석법(Mass Spectometry) 35
(4) 원편광 이색성 분광법(CD spectroscopy) 37
(5) 액체상 NMR을 이용한 tIK series의 구조 연구 38
(6) IL-10Rα를 처리한 펩타이드의 HSQC 스펙트라 43
B. 시약 및 기구 45
(1) tIK series의 발현 45
(2) tIK series의 분리 및 정제 46
(3) 질량분석법(Mass Spectometry) 50
(4) 원편광 이색성 분광법(CD spectroscopy) 50
(5), (6) 액체상 NMR을 이용한 tIK series의 구조 연구와 IL-10Rα를 처리한 펩타이드의 HSQC 스펙트라 51
III. 결론 및 토의 52
IV. 참고문헌 53
V. 학술대회 및 논문발표 실적 57
표 1. 관절염 마우스 모델 실험의 세포 내 단백질의 인산화 패턴 변화. 15
표 2. M9 media의 조성. 21
표 3. 세포 파쇄와 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 사용된 buffer의 조성. 26
표 4. SDS-PAGE에 사용된 gel의 조성 30
표 5. HPLC gredient flow의 시간별 조성. 33
표 6. HPLC 수행 조건. 33
그림 1. PSI-BLAST를 사용해 얻은 tIK 단백질의 구조. 14
그림 2. IL-10과 IL-10Rα의 도킹 시뮬레이션(Docking simulation)과 tIK 단백질과 IL-10의 시퀀스 정렬 (Sequence alignment). 16
그림 3. 4종 펩타이드에 대한 TH17 세포 분화 실험.[이미지참조] 17
그림 4. tIK 펩타이드 3종에 대한 KSI 융합 발현 벡터의 개략도. 시판용 벡터인 pET31b(+)를 사용하였고, 소수성을 띄게 하는 KSI와 정제 과정을 위한... 19
그림 5. Ni2+와 배위 결합을 하는 표적 펩타이드.[이미지참조] 24
그림 6. CNBr을 이용한 화학적 절단 매커니즘. 29
그림 7. tIK series의 SDS-PAGE. 1 번 레인은 특정 분자량의 밴드 위치를 나타내는 marker이고, 2 번과 3 번은 각각 induction 전과 후를 나타낸다. 4 번과 5 번은 lysis... 31
그림 8. tIK series의 HPLC 크로마토그램. gradient method를 통해 27-30 분 사이에 펩타이드를 회수할 수 있도록 optimization 하였다. 붉은 색의 박스는 각 펩타이드의... 34
그림 9. tIK series의 MALDI-TOF 스펙트라를 통한 분자량 확인. 스펙트라를 통해 얻은 분자량이 각 펩타이드의 아미노산 서열을 통해... 36
그림 10. tIK series의 CD 분광법 결과. tIK series는 아미노산의 개수가 늘어날수록 α-helix의 패턴에서 random coil의 비율이 늘어나는 경향성을 보였다. 37
그림 11. 균일하게 15N이 표지된 tIK series의 ¹H-15N HSQC 스펙트라. 각 아미노산의 개수보다 하나 부족한 cross peak이 검출되었다.[이미지참조] 39
그림 12. 선택적으로 15N이 표지된 tIK series의 ¹H-15N HSQC 스펙트라. Isotope scrambling이 많이 발생하지 않는 Alanine, Isoleucine, Valine,...[이미지참조] 41
그림 13. tIK series 스펙트라의 assign. 앞서 진행한 ¹H-15N HSQC 실험들의 결과를 바탕으로 cross peak에 해당하는 아미노산을 assignment 하였다.[이미지참조] 42
그림 14. IL-10Rα가 존재할 때, tIK series의 ¹H-15N HSQC 스펙트라의 변화. 위에서부터 임의의 숫자를 각 cross peak에 배정하였다. 특히 18mer에서 3 번...[이미지참조] 44
그림 15. Chemical shift perturbation. 그림 14에서 임의로 숫자를 배정한 cross peak의 chemical shift 차이를 도식화하였다. 18mer의 3 번 cross... 44