PART I. 마우스 방사선 직장염 모델에서의 대장 오가노이드 이식에 의한 장 기능 회복 연구
방사선 직장염은 골반 내 악성 종양에 대한 방사선 치료과정에서 발생하는 질환으로 암세포를 사멸하기 위해 방사선을 조사 하는 동안 직장부위의 건강한 세포도 손상되어 일어나는 것이 주원인으로 알려져 있다. 이를 위한 치료방법으로는 직장내부의 염증증상을 완화시키기 위한 보존적 치료가 시행되고 있지만 손상된 대장 상피조직을 회복시키는 데에는 한계가 있다.
따라서 본 연구는 성체조직에서 유래된 대장 오가노이드를 사용하여 방사선 직장염 치료제를 개발하기 위해서, 마우스의 직장부위에 방사선을 조사한 후 CAG-EGFP 마우스에서 추출한 대장 오가노이드를 이식하여 장 상피조직의 재생을 유도 및 관찰 하였다. 방사선 직장염 모델은 일반 마우스의 직장부위에 50 Gy의 방사선을 조사하여 제작 하였고, CAG-EGFP 마우스로부터 유래된 EGFP 대장 오가노이드를 항문에 주입하여 이식하였다.
특히 본 연구에서는 내시경장비와 피브린 접착제를 사용하여 방사선 조사 부위에 대장 오가노이드를 이식하는 방법을 개발하였으며, 손상된 장의 구조와 기능 회복을 확인하기 위하여, 대장 오가노이드 이식후 장조직의 병리학적 분석과 내시경관찰, 고분자 화합물 투과성 실험을 실시하였다. 그 결과 이식된 대장 오가노이드는 방사선으로 손상된 마우스 결장 조직에 성공적으로 정착하여 장 Crypt를 재건하였으며, 장의 구조적, 기능적 회복을 유도한 것으로 확인 되었다.
그리고 Single cell RNA 염기서열 분석법을 통해 대장 오가노이드가 이식된 결장 조직에서 장 줄기세포가 존재함을 알 수 있었고, 이러한 장 줄기세포들이 효과적으로 장 상피 계열의 세포들로 분화되었음을 확인 하였다. 또한, 우리는 Lgr5의 발현이 대장 오가노이드 이식후 장 상피 회복에 중요한 역할을 한다는 것을 확인 하였다.
따라서 우리는 방사선 치료에 의해 손상된 장 상피 조직에 대장 오가노이드 기반의 세포치료가 가능하다는 것을 입증 하였다.
PART II. 마우스 장 상피 손상 모델에 대장 오가노이드 이식시 사용할 수 있는 지지체의 생체 내 평가
대장 오가노이드는 장 표면조직과 유사한 구조와 기능을 지닌 것으로 알려져 있으며, 탈피성 장질환에 유용한 치료제로 활용 될 수 있다. Matrigel은 대장 오가노이드 이식연구에서 지지체로서 사용되고 있지만, 불명확한 구성성분과 종양형성을 유도할 수 있는 위험성을 내재하고 있어 임상적으로 사용되지 못하고 있다. 따라서 본 연구의 목적은 손상된 장 점막에 대장오가노이드를 이식 할 때 임상적으로 사용할 수 있는 지지체를 개발 하는 데에 있다.
CAG-EGFP 마우스로부터 colon crypt를 분리하여 EGFP+ colonoid 배양을 실시하였으며, 이를 gelatin, collagen, fibrin glue 와 같은 지지체들과 혼합하여, EDTA 대장염 마우스 모델에 이식하였다. 그리고 대장 오가노이드 이식에 적합한 지지체 선별을 위해 대장 오가노이드 이식 후 각 지지체별 이식성공률과 2차 오가노이드 형성 실험을 실시하였고, 지지체의 독성 여부를 알아보기 위하여, in vitro 와 in vivo에서 각 지지체별 독성 테스트를 진행 하였다.
그 결과, 지지체로 사용한 gelatin, collagen, fibrin glue 모두 EDTA 대장염 마우스 모델에 성공적으로 대장 오가노이드를 생착 시킬 수 있다는 것을 확인 하였다. 특히, 이식 후 4주차의 Fibrin glue의 생착 면적은 대조군으로 사용한 Matrigel 보다 넓은 것을 확인하였다.
본 연구에서 사용한 지지체들은 생체 내 이식 후 장 독성을 유발하지 않았고, 이는 국소적인 이식에 안전하게 활용 가능한 것을 의미한다. 따라서 이러한 연구결과를 바탕으로 대장 오가노이드 기반의 치료제 개발시 임상적으로 안전하게 활용 가능한 새로운 이식방법을 제안하는 바이며, 이는 세포 치료제 개발 연구에 있어서 식도와 위장과 같은 다양한 소화기 질환에서도 적용 가능할 것으로 사료 된다.
PART III. 위장관 유래 오가노이드 배양을 위한 콜라겐 기반 3D 매트릭스 개발
오가노이드는 3차원 배양 조건에서 성장하는 세포조직체로서 각 조직유래의 특성을 지닌다. 하지만, 각 기관 특이적인 구조 및 특성과 기능을 유지하기 위해서는 3차원 매트릭스가 필수적으로 필요하다. 현재 오가노이드 배양에 Matrigel 이라는 매트릭스가 사용되고 있지만, 이는 마우스의 sarcoma 에서 유래된 물질로서 그 구성성분이 불명확하여 임상적으로는 사용할 수 없는 것으로 알려져 있다. 반면에, Collagen은 오가노이드와 정상조직 모두 독성 없이 사용이 가능한 특성을 가지고 있다.
따라서, 본 연구는 오가노이드 배양에 있어서 Matrigel을 대체 할 수 있는 새로운 매트릭스로서 Collagen을 선정하여 연구 하였다. Type 1 Collagen과 Ham's F12 nutrient, bicarbonate를 혼합하여 Collagen 기반 매트릭스를 제작하였으며, 기본적인 배양조건은 마우스 대장오가노이드를 사용하여 그 특징적인 morphology 관찰과 mRNA 정량 발현을 통하여 수립하였다. Collagen 기반 매트릭스에서 대장 오가노이드를 배양한 결과 대조군으로 진행한 Matrigel 실험 군과 유사한 morphology와 대장 특이적인 마커들의 발현 그리고 증식률이 관찰되었다. 추가적으로 마우스의 소장, 위장 오가노이드 그리고 인간 대장 오가노이드 역시 배양을 실시하였으며, 모든 오가노이드들이 collagen 기반 매트릭스 에서 성공적으로 성장하는 것을 확인하였고, Matrigel 실험군과 비교 하였을 때에도 유사한 특성을 지니는 것으로 나타났다. 또한, collagen 기반 매트릭스에서 배양한 마우스 대장 오가노이드를 EDTA 대장염 마우스 모델에 이식을 하였을 때에도 대장 오가노이드들이 성공적으로 손상된 조직에 이식이 되는 것을 확인 하였다. 따라서 본 연구 결과를 바탕으로 오가노이드 배양시 Collagen 기반 매트릭스를 활용하면 좀 더 저렴하면서도 임상적용이 가능한 오가노이드 제작이 가능할 것으로 사료 된다.