지질 매개체(lipid mediators)는 세포막의 구성 요소인 다중 불포화 지방산 (PUFA) 으로부터 전환되어 염증의 종결을 위해 면역 세포의 신호 전달에 관여하는 중요한 생물 활성 분자이다. 지질 매개체는 리폭시제네이즈(lipoxygenases, LOXs)에 의해서 생합성 되는데, 이 효소는 하나 이상의 1-시스,4-시스-펜타디엔 구조를 포함하는 다중 불포화 지방산에 위치 및 입체 특이적으로 과산화 반응을 촉매 한다.
이 연구의 목적은 비 포유류 종에서 아직 기능이 알려지지 않은 리폭시제네이즈를 탐색하고, 효소 반응을 통해 신규 구조의 지질 매개체를 생합성 하는 것이다. 따라서 우리는 cyanobacteria에 속하는 Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 유래의 Osc-LOX로 명명된 다기능 효소를 선별하였다.
osc-lox 유전자는 64.9 kDa의 분자량을 갖는 571 개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화한다. 이 효소는 Coffa 서열 부위에 다중 불포화 지방산에 형성되는 작용기의 위치 및 입체 특이성을 결정하는 핵심 아미노산으로 알라닌을 가짐으로써 S-특성의 LOX로 분류된다. Osc-LOX는 대장균 단백질 발현 시스템에서 단량체로 발현되었으며, 효소 반응에 대한 최적의 pH 및 온도는 pH 8 및 30 ℃로 확인되었다. ICP-MS 분석을 통해 LOX의 활성 부위에 결합하여 효소 반응에서 중요한 역할을 하는 금속 이온을 확인 하였으며, 몰 비율 89.2 %와 10.8 %로 각각 아연(2.56μM)과 구리(0.31μM)가 검출되었다. 지방산에 대한 Osc-LOX의 특이적 효소 활성은 AA에서 가장 높았으며, 다음으로 AA〉 EPA〉 DHA 의 순서로 확인되었다. DHA를 기질로 사용한 반응을 통해 사용한 효소의 농도에 따라 총 3가지의 전환 물질이 생성되었으며, 50 Unit mL-1 농도에서 17SHDHA, 100-200 Unit mL-1 농도에서 resolvin D5 (RvD5), 그리고 400 Unit mL-1 농도에서 7S,15R-하이드록시-16S,17S-에폭시-도코사펜타엔산의 구조를 갖는 신규 구조의 헤폭실린 유사체 (dihydroxy-hepoxilin B5, DHXB5)가 생성되는 것으로 확인되었다. 이 연구에서 단일 효소 반응을 통해 서로 다른 계열에 속하는 지질 매개체인 resolvin과 hepoxilin을 동시에 합성할 수 있는 다기능 LOX를 처음으로 보고하였다. DHXB5는 NaOH를 이용한 염기 촉매 에폭사이드 고리 열림 반응에 의해 7S,15R,16S,17S-테트라하이드록시-도코사펜타엔산 (tetraoxilin B5, TetXB5)으로 추가로 전환되었으며, 이 전환 물질은 또 다른 신규 구조의 지질매개체로 확인되었다. 또한, 염기 촉진 에폭사이드 고리 열림 반응의 부산물로써 7S,16R,17S-트리하이드록시-도코사헥사에노익산 (resolvinD2, RvD2)이 생산되었다.
LOX의 기질에 대한 위치 및 입체 특이성은 coffa 결정 인자로 알려진 아미노산인 알라닌(S-형태 LOX)과 글라이신(R-형태 LOX)에 의해 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. Osc-LOX는 296번 아미노산 위치에 알라닌이 존재하며, 앞서 수행한 연구를 통해 13S-형태의 LOX로 확인되었다. 따라서 Osc-LOX의 알라닌을 글라이신으로 치환하여 13S-형태에서 9R-형태의 LOX로 특성을 변화시킴으로써 야생형과 다른 지질 매개체를 생산하고자 하였다. Osc-LOX 변이형의 효소 반응을 위한 최적 pH 및 온도는 pH 8 및 30℃로 확인되었으며, 이는 야생형 LOX와 다르지 않았다. 그러나, Osc-LOX 변이형의 지방산에 대한 특이적 활성은 야생형과는 반대로 DHA에서 가장 높았으며, 다음으로 AA〉 EPA〉 DHA 의 순서로 확인되었다. DHA를 기질로 사용한 효소 반응을 통해 2 종류의 지질 매개체가 생성되었으며, 효소의 농도에 따라 50 Unit mL-1의 농도에서 13R-HDHA가 전환되었고 200 Unit mL-1의 농도에서 13R,20-다이하이드록시-도코사헥사에노익산(13R,20-diHDHA)의 구조를 갖는 지질 매개체가 전환 물질로 확인되었다. 13R,20-다이하이드록시-도코사헥사에노익산은 염증의 해소 단계에서 생성되는 DHA의 대사체로 확인된 바 있지만, 현재까지 생체 외에서 합성 가능한 효소가 알려지지 않았으므로 Osc-LOX 변이형은 13R,20-diHDHA를 합성할 수 있는 효소로 처음 보고하였다.
LOX 또는 LOX 유사 효소가 거의 대부분의 유기체에 존재하지만, 그들의 효소적 특성 및 이들이 생성하는 지질 매개체의 유형은 완전히 이해되지 않았다. 따라서, 기능적으로 특성화 되지 않은 새로운 효소를 발견하고 효소의 특성을 이해하는 것은 생리학적 연구 및 제약 연구를 위해 중요한 지질 매개체의 생산을 위한 강력한 도구로써 이용될 수 있을 것이다.