표제지
목차
1. 연구개요 12
1) AMPs(Antimicrobial Peptides) 연구 현황 12
(1) AMPs의 연구 현황 및 작용 기작 12
(2) AMPs의 특성 16
2) 곤충 유래 AMPs 23
(1) 곤충 유래 AMPs의 분류 23
(2) 곤충 유래 AMPs의 작용 기작 연구 현황 25
(3) 곤충에 따른 AMPs의 분포 27
3) 백신 35
(1) 백신의 필요성 35
(2) 백신 adjuvant 36
(3) 백신접종 항원의 세포 내 메커니즘 37
(4) 다 기능성의 백신 전달 시스템 37
4) 살모넬라증에 대한 백신 추이 39
(1) 살모넬라 임상 증상 39
(2) 살모넬라 발병(Salmonella pathogenesis) 39
(3) 살모넬라 백신(Salmonella vaccines) 40
2. 서론 42
3. 재료 및 방법 44
1) 사용한 균주 및 시약 44
2) 합성 마스토파란의 항균 활성 측정 46
3) Minimal inhibitory concentration (MIC) 측정 46
4) Protease inhibitor에 따른 항균 활성 검사 46
5) MP-V1 유전자의 대장균 안으로 형질 전환을 위한 plasmid 구축 47
6) 형질 전환된 대장균의 plasmid 확인 및 제한 효소 처리 47
7) Dot blotting 48
8) SDS-PAGE와 Western blotting 48
9) 대장균 분비 시스템에서 얻은 상등액의 항균 활성 분석 49
10) Scanning-electron eicroscope (SEM) analysis 49
11) 고스트화 및 잔존 생균수 측정 49
12) E protein과 동시 처리에 따른 고스트화 상승효과 50
13) Salmonella Typhimurium 및 Gallinarum 고스트 백신의 제조 50
14) 시험 동물 마우스의 살모넬라 고스트 백신의 virulent Salmonella Typhimurium에 대한 보호능력 관찰 51
15) 목적 동물 닭의 살모넬라 고스트 백신의 Salmonella Gallinarum에 대한 보호능력 관찰 51
16) 산업화를 위한 목적 동물 닭에서 Salmonella Gallinarum 고스트 백신의 소규모 효능평가 51
17) 통계처리 52
4. 결과 54
1) 마스토파란의 화학적 특성 54
2) 6종의 마스토파란 항균 활성 측정 결과 57
3) Minimal inhibitory concentration (MIC) 측정 결과 59
4) Protease inhibitor에 따른 항균 활성 검사 61
5) MP-V1 유전자의 대장균 안으로 형질 전환을 위한 plasmid 구축 64
6) 클로닝된 plasmid DNA 확인 및 제한 효소 처리 결과 67
7) Dot blot 및 western blot 결과 69
8) 분비된 MP-V1의 항균 효능 평가 72
9) Protease inhibitor를 이용한 배양 상등액의 항균 활성 결과 74
10) Salmonella 고스트 백신 제조 결과 76
11) E protein과 MP-V1의 상승효과 78
12) 독력 S. Typhimurium 균주에 대한 마우스의 방어 효능 결과 80
13) 실험동물인 마우스에서의 면역 반응 결과 82
14) 챌린지에 대한 닭의 방어 효능 결과 85
15) 산업화를 위한 닭에서 Salmonella Gallinarum 고스트 백신의 소규모 효능평가 결과 87
5. 고찰 89
(1) 마스토파란의 항균 작용 양상 89
(2) Protease inhibitors를 이용하여 inoculum effect (IE) 회피를 통한 MP-V1의 anti-Salmonella 활성 조절 90
(3) OmpA SS를 이용한 E. coli 분비 시스템에서 MP-V1의 효율적인 생산 91
(4) 고스트 백신의 효능 평가 94
6. 참고문헌 96
7. 초록 105
8. ABSTRACT 108
Table 1. Proline-rich antimicrobial peptides 31
Table 2. Bacterial strains and plasmids used for this study 45
Table 3. Amount of vaccination per group 53
Table 4. Mastoparans used for this study 55
Fig. 1. AMPs originated from invertebrate. 13
Fig. 2. Functional classification of AMPs originated from invertebrate. 14
Fig. 3. Classification of invertebrate AMPs depending on peptide... 19
Fig. 4. Classification of invertebrate AMPs depending on peptide... 20
Fig. 5. Classification of invertebrate AMPs depending on Net charge. 21
Fig. 6. Classification of invertbrate AMPs depending on hydrophobic... 26
Fig. 7. Evolution of AMPs in insects. 29
Fig. 8. Structures of an insect defensin, drosomycin, cecropin and... 33
Fig. 9. Identification of artifically synthesized mastoparans. 56
Fig. 10. Antibacterial activity of mastoparans. 58
Fig. 11. Antimicrobial activity of mastoparan V1 (MP-V1) against three... 60
Fig. 12. Effect of protease inhibitors on antimicrobial activities of... 62
Fig. 13. Effect of EDTA on antimicrobial activities of MP-V1 in the... 63
Fig. 14. Artificial synthesis of Ptrc :: ompA SS :: MP-V1 . 65
Fig. 15. Construction of ompA SS :: MP-V1 cassette. 66
Fig. 16. Identification of clonning for T-easy :: P trc ::ompA SS and... 68
Fig. 17. Results of dot blotting assay. 70
Fig. 18. SDS-PAGE and Western blot for secreted ompA SS::MP-V1. 71
Fig. 19. Examination of antimicrobial activity with the OmpA... 73
Fig. 20. Effect of protease inhibitors on antimicrobial activities of the... 75
Fig. 21. Results of viable cell count. 77
Fig. 22. Synergic effect of antimicrobial activity according to... 79
Fig. 23. Survival ratio of mice after challenge with virulent Salmonella. 81
Fig. 25. IL-10 (pg/mL) and TNF- α (pg/mL) concentrations in the... 84
Fig. 26. Survival Ratio of Chickens after challenge with virulent... 86
Fig. 27. Comparison of survival ratio with commercial vaccine products... 88
Fig. 28. Secretion of MP-V1 to the extracellular space through the... 93