Oxidative stress로 발생하는 apoptosis에서 phospholipase C (PLC)-β1의 역할을 규명하고자 NIH3T3 섬유아세포에서 PLC-β1 효소가 영구적으로 과발현되는 NIH/PLC-β1 세포주를 확립하고, NIH/neo 비교 세포주와 PLC-β1 과발현 세포주에서 tert-butylhydroperoxide (t-BH)처리에 의한 oxidative stress로 유발되는 apoptosis에 대하여 PLC-β1 효소의 조절 기전을 조사 하였다.
두 세포에 100μM 농도의 t-BH를 처리하고 PLC 효소 활성도는 NIH/PLC-β1 세포에서 처리 2시간과 8시간 후에 효소 활성이 약 2배와 1.8배로 각각 증가되었지만 NIH/neo 세포에서는 효소 활성에 별 변화가 없었다. 50 μM 농도의 t-BH를 처리한 후, 시간에 따른 세포 형태를 광학 현미경에서 관찰한 결과 NIH/neo 세포에서는 현저한 변화와 세포 죽음을 관찰할 수 있었으나, NIH/PLC-β1 세포에서는 저항성을 보였다.
세포생존율 관찰에서 0, 50, 100, 200 μM 농도의 t-BH를 각각 처리하였을 때 NIH/neo 세포는 각각 100%, 60%, 15%, 8%로 농도 의존적으로 현저한 세포 독성을 관찰하였으나, NIH/PLC-β1 세포에서는 100%, 90%, 80%, 75%로 약간 억제되었다. 또 TUNEL assay를 시행함으로서 t-BH를 세포에 처리한 후 apoptotic DNA를 확인할 수 있었으며, NIH/PLC-β1 세포에서는 NIH/neo 세포에 비해 apoptotic DNA 생성이 현저히 감소되어 있음을 관찰하였다. t-BH에 의해 생성되는 DNA fragmentation 정도를 ELISA로 정량한 결과 NIH/neo 세포에서는 t-BH를 처리 3시간 이내에 DNA fragment 들이 45%가 생성되었나, 6, 9, 12시간 후에는 각각 82%, 90%, 85%로 관찰되었다. 이와 비교하여 NIH/PLC-β1 세포에서는 t-BH 처리 후 서서히 증가하여 12시간에 약 30%가 생성 되었다.
NIH/neo 세포에서 JNK 효소 활성은 t-BH 처리 30분 이내에 활성이 증가되어 c-Jun을 인산화 시키지만, NIH/PLC-β1 세포에서는 JNK 효소 활성을 전혀 관찰 할 수가 없었다. 유전자발현을 관찰하기 위하여 Northern hybridization한 결과 NIH/neo 세포에서는 c-fos 유전자 발현이 t-BH 처리 30분 이내에 최대 증가를 보였으며 c-jun 유전자 발현의 증가 역시 관찰되었으나, NIH/PLC-β1 세포에서의 c-fos 유전자 발현이 억제되어 있었다. 이에반해 c-jun 유전자 발현과 GAPDH 유전자 발현은 양 세포간에 특별한 발현 변화가 없었다.
이상과 같은 결과들에서 세포내 각종 라디칼을 생성케 하는 t-BH는 세포의 apoptosis 과정을 촉진하여 세포 죽음을 유도하며, 대조 세포주인 NIH/neo 세포에서는 JNK 효소가 활성화 되고 c-fos, c-jun 등과 같은 immediate early gene의 발현 증가가 유도되어 apoptosis가 진행되는데 비해, PLC-β1이 과발현된 NIH/PLC-β1 세포에서는 JNK 효소 활성 억제와 c-fos 유전자 발현 억제를 통하여 산소 독성에 의한 apoptosis 진행을 억제하는 것으로 추정할 수 있다.