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[표지]
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CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 8
1. 연구개발 목적 8
2. 연구개발의 필요성 8
2-1. 3차원 세포 클러스터 형성의 필요성 8
2-2. 기존 3차원 세포 형성 방법 9
2-3. 새로운 3차원 세포 형성 기술의 요구 및 전망 9
2-4. 기능성 나노구조체를 이용한 3차원 형성법의 장점 10
3. 연구개발 범위 10
제2장 국내외 기술 개발 현황 12
1. 국내 관련 분야 기술개발현황 12
2. 국외 관련 분야 기술개발현황 12
제3장 연구 수행 내용 및 성과 13
1. 3차원 세포 구조 형성을 위한 자기력 시스템 셋업 20
가. 하나의 영구 자석에 철 핀이 있는 시스템과 없는 시스템의 자기력 비교 20
나. 일련의 집합을 이루는 영구 자석에 철 핀이 있는 시스템과 없는 시스템의 자기력 비교 21
다. 영구 자석에 철 핀이 있는 시스템과 없는 시스템의 세포 응집 비교 22
2. 3차원 세포 구조물을 위한 다양한 조건의 최적화 23
가. 자성 나노 입자가 도입 된 세포의 수에 따른 클러스터의 크기 23
나. 3차원 세포 클러스터 형성 시간 25
다. 자성 나노 입자의 농도 26
3. 자성 나노 입자가 도입된 세포의 생존력 확보 27
가. 화학적으로 합성 된 자성 나노 입자의 세포 독성 (3 세무 협력) 27
나. 생물학적으로 합성 된 자성 나노 입자의 세포 독성 27
4. 3차원 세포 배양이 세포의 생존력에 미치는 영향 28
가. 3차원으로 구현된 세포 클러스터의 생존력 확인 28
5. 다른 종류의 세포틀 사용하여 다양한 형태의 3차원 세포 클러스터 형성 29
가. 두 가지 다른 세포의 무작위적 섞임 29
나. 두 가지 다른 세포가 층을 이루어 3차원 세포 클러스터 형성 29
다. 두 가지 다른 3차원 세포 글러스터의 응집 29
6. 세포 응집 시스템에 따른 3차원 세포 클러스터 간 응집 양상 비교 30
7. 3차원 줄기세포 클러스터의 배양 동안 일어나는 분화 양상 관찰 31
가. 역전시-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)을 통한 분화 마커의 발현 확인 31
8. iPSCs 제작을 위한 조건 확립 및 효율성 검증 32
가. iPSCs 제작을 위한 4가지 유전자(일명 Yamanaka factors)를 전달하는 데 사용되는 매개체로서 retro 바이러스를 제작하기 위해 gene transfaction을 유도하고 효율을 검증 32
9. 마우스 iPSCs 역분화 유도 및 제작 33
가. 정제된 retro 바이러스 매개의 4 가지 유전자를 마우스 체세포에 전달 33
나. 마우스 체세포에 전달된 바이러스의 실효능 확인 34
다. 마우스 체세포 역분화 유도 및 마우스 iPSCs를 제작 35
10. 인간 iPSCs 역분화 유도 및 제작 37
가. 정제된 retro 바이러스 매개의 4 가지 유전자를 인간 체세포에 전달 37
나. 인간 섬유아세포(HDF)의 역분화 유도 및 인간 iPSCs 제작 38
11. iPSCs 3차원 줄기세포 형성 조건 확립 39
가. iPSCs의 3차원 줄기세포 형성을 통해 3차원 배아줄기세포 및 3차원 성체줄기세포를 각각 형성하고 조건 최적화 39
12. iPSCs 3차원 줄기세포 분화방법 확립 40
가. iPSCs의 3차원 줄기세포 분화방법 확립을 위해 3차원 배아줄기세포를 형성하여 초기 분화단계를 확립 40
13. iPSCs 3차원 줄기세포 형성을 통한 역분화 효율 증대 유도 42
가. iPSCs의 역분화 효율을 높이기 위해 3차원 줄기세포 형성과정을 iPSCs 제작 과정에 삽입 42
14. 생물학적 합성 자성나노입자 표면개질화 (3세부 협력) 43
가. 생물학적으로 합성된 박테리아 유래의 자성나노입자를 동물세포에 사용 적합하도록 표면개질화 43
15. 기능성 나노구조체 확보 및 세포독성, 기능성 확인 (3세부 협력) 44
가. 3세부에서 합성한 다양한 형태의 염기성 섬유모세포생장인자 (bFGF) 담지 자성나노입자의 독성을 확인하고 담지 물질의 기능성을 학인하기 위해 세포 생장 효율을 측정함 44
나. 3세부에서 제작한 옻나무 추출물 이용 나노필름의 세포 독성을 검사함 45
16. iPSCs 역분화 시 비바이러스성 생체재료의 영향과 효과 46
가. iPSCs 제작시 유전자를 전달하는 매개체로서 retro 바이러스의 단점을 극복하고자 세포 투과성 단백질을 대체 매개체로 사용하여 역불화를 유도하고 그 효율을 확인함 46
17. iPSCs 역분화 시 나노구조체 자체의 영향 검토 47
가. iPSCs 역분화 효율을 증대하기 위해 박테리어 유래의 자성나노입자를 처리하고 역분화 경향 관찰 47
18. 나노구조체를 기반으로 하여 인간배아줄기세포와 feeder cell (transfected with DsRed)의 다양한 형태 공배양 시도 48
가. 인간배아줄기세포와 feeder cell (DsRed-STO)의 다양한 형태 3차원 곰배양 48
19. 나노구조체 기반의 다양한 크기의 3차원 줄기세포 형성 49
가. 자성나노입자 및 자기력 시스템 기반의 3차원 줄기세포 크기조절 49
20. 자성나노입자 기반의 자기력 시스템 하 3차원 줄기세포의 초기 분화 확인 50
가. 줄기세포의 미분화 상태를 표지하는 pluripotency 마커 Oct 4의 발현 레벨 확인을 통한 3차원 줄기세포의 분화 상태 확인 50
21. 자성나노입자 도입 원심분리에 의한 3차원 중간엽줄기세포의 장기 분화 확인 51
가. 자성나노입자가 도입 중간엽줄기세포의 자기력 기반 물리적 자극에 의한 연골분화 51
나. 자성나노입자의 중간엽줄기세포에의 도입 52
다. 자성나노입자 기반의 3차원 중간엽줄기세포의 연골 조직으로의 분화 확인 53
22. 연골로 분화시킨 나노구조체 기반의 3차원 중간엽줄기세포의 tissue assembly 가능성 타진 54
가. 3차원 중간엽줄기세포의 연골 조직으로 분화 및 관찰 54
23. 이종 조직 세포 간 혼합 assembly 시도 55
가. 중간엽줄기세포와 피부유래 세포의 혼합 assembly 시도 55
24. 크기가 서로 다른 3차원 줄기세포에서 발현되는 transcription factor의 레벨 차이 확인 56
가. 크기가 서로 다른 3차원 줄기세포에서 외배엽성 분화 세포의 transcription factor인 Gtap의 발현 레벨 비교 56
나. 크기가 서로 다른 3차원 줄기세포에서 내배엽 및 중배엽성 분화 세포의 transcription factor인 Brachyury (T)의 발현 레벨 비교 57
25. 신경분화 마커 발현 확인 및 세포의 phenotype 관찰 58
가. 크기가 작은 3차원 줄기세포에서 나타나는 외배엽성 분화의 심화 및 신경세포로의 분화 발전 가능성 58
26. 자성나노입자를 이용한 줄기세포의 삼차원 형태 구현 및 tissue assembly의 효과적인 형성을 위한 줄기세포의 분화 안정성 확보 (2세부 협력) 59
가. 자성나노입자의 농도에 따른 중간엽줄기세포의 모습 관찰 59
나. 자성나노입자 및 외부자기력시스템을 이용한 삼차원 줄기세포 구현 60
다. 이차원과 삼차원 중간엽줄기세포의 연골분화 유도 비교 62
27. 자성나노입자를 이용한 줄기세포에의 물리적 자극 전달과 이를 통한 세포 내 mechanotransduction 유도 64
가. 자성나노입자를 이용한 물리적 자극 전달 방법에 대한 논의 64
나. 자성나노입자 기반의 물리적 자극에 대한 중간엽줄기세포의 골분화 반응 65
다. 자성나노입자 기반의 물리적 자극에 대한 세포 단위의 정량화 66
28. 자성나노입자를 이용해 줄기세포의 세포 간 interaction을 증진시키고 이를 통해 분화에 적합한 extracellular matrix (ECM; 세포외기질) 분비를 유도 (2세부 협력) 67
가. 자성나노입자를 이용한 삼차원 조골전구체 줄기세포 구현 및 세포외기질 분비 유도 67
나. 세포주로부터 수집한 세포외기질의 분리 및 이를 이용한 삼차원 스캐폴드 제작 69
29. 심장의 심실벽 구성 조직인 심근조직의 효과적인 구현을 위해 이를 구성하는 주 요 세포인 cardiac fibroblast와 cardiomyocyte를 in vivo(mouse)로부터 분리 (2세부 협력) 71
가. Mouse 심근조직의 구성세포 분리 71
30. 세포치료제로서 생체 내에 이식하는 세포의 효율 증대를 위한 자성 기반의 retention 기법에 대한 논의 72
가. 자성나노입자의 in vivo 적용 가능성의 외과적 논의 72
31. 동물 두개골 결함 모델에 이식한 줄기세포 및 scaffold를 이용한 골분화 및 골 조직 재생 확인 (2세부 협력) 73
가. 골분화 유도 및 이를 통한 골조직 73
32. 세포주 유래 물질 (세포외기질)을 이용한 in vivo 모사 환경 구현 74
가. 세포주로부터 세포외기질을 효과적으로 분리 및 정제 74
나. 분리해 낸 세포외기질의 속성 확인 및 표면 관찰 75
다. 분리 및 정제한 세포외기질을 이용한 in vivo 모사 삼차원 구조체에서 세포 배양 76
33. 세포주에서 분리 및 정제한 세포외기질을 이용해 구현한 in vivo 모사 환경의 줄기세포 골분화유도능 확인 77
가. 골전구체 세포를 배양하여 분리 및 정제한 세포외기질과 대표적 세포외기질 구성물질인 collagen과 종간엽줄기세포 골분화유도능 비교 77
34. 피부세포의 증식 및 피부조직의 상처 치료에 관여하는 bFGF의 단백질 안정성 증진을 위한 30Kc19a와 bFGF의 결합단백질 이용 79
가. 30Kc19a와 bFGF 결 합단백질의 생산 79
나. 시간의 흐름에 따른 단백질 안정성의 비교 80
다. 결합단백질의 in vivo 적용 가능성 검토를 위한 wound healing assay 81
35. 상처난 in vivo 모델에서 30Kc19a-bFgF 결합단백질의 wound healing 효과 확인 82
가. 피브린 겔을 이용한 in vivo 모델에서 상처부위 치료 효과 확인 82
나. 피부 조직의 상처가 재현된 in vivo 모델에서 bFGF와 30Kc19a-bFGF의 상처 치유 효과의 조직학적 비교 분석 83
제4장 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 85
1. 목표 달성도 85
(1) 연구개발의 최종목표 85
(2) 연차별 연구개발 목표 및 내용 86
(3) 계획대비 달성도(선정 시 제시된 연구목표) 88
(4) 위 연구목표(총연구기간)에서 중요도 순으로 4~5개 목표 추출 및 가중치 부여(세부연구목표는 5개를 넘을 수 없으며, 총괄과제의 경우 세부과제의 내용을 포함하여 작성) 89
2. 관련 분야 기여도 89
제5장 연구개발성과의 활용계획 90
1. 추가연구의 필요성 90
2. 다른 연구에의 응용 및 기업화 추진방안 90
2-1. 연구개발결과의 활용방안 90
2-2. 기대성과 90
제6장 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 94
제7장 연구개발성과의 보안등급 94
제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 94
제9장 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 94
제10장 연구개발과제의 대표적 연구 실적 95
제11장 기타 사항 98
제12장 참고문헌 98
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가상서가
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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