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목차
논문개요 16
제1장 서론 19
제2장 실험 재료 22
제1절 실험 재료 22
제2절 시약 및 실험동물 22
제3장 실험 방법 24
제1절 국내산 citrus 과피 유래 다당의 분리 및 활성선별 24
제1항 Citrus 과피 유래 기능성 다당의 분리를 위한 시판효소의 처리 24
제2항 Citrus 과피(감귤, 청귤, 한라봉) 유래 조다당 분리를 위한 시간별 효소처리 24
제3항 Citrus 과피(감귤, 청귤, 한라봉) 유래 시간별 효소처리 조다당 정제도 확인 25
제4항 Cytokine 생산유도 활성 25
제2절 청귤 과피 유래 기능성 획분의 분리, 정제 및 면역 활성 29
제1항 청귤 과피 유래 조다당의 분리 29
제2항 청귤 과피 유래 조다당의 정제 30
제3항 청귤 과피 유래 다당의 정상세포 및 암세포에 대한 세포독성 측정 30
제3절 정맥투여를 통한 청귤 과피 유래 다당의 면역 활성과 항전이 효과 32
제1항 자연 살해 세포(NK cell)에 의한 종양세포 살해능 32
제2항 정맥투여를 통한 종양세포에 대한 항전이 활성(Anti-metastatic activity) 33
제3항 NK cell 기능이 제어된 mouse에서의 항전이 활성(Antimetastaticactivity) 33
제4항 세포독성 T 림프구에 의한 종양세포 살해능(CTLactivity) 34
제4절 경구투여를 통한 청귤 과피 유래 다당의 면역 활성과 항전이 효과 35
제1항 경구투여를 통한 자연 살해 세포(NK cell) 활성화 35
제2항 경구투여를 통한 종양세포에 대한 항전이 활성(Antimetastaticactivity) 35
제3항 경구투여를 통한 세포독성 T 림프구에 의한 종양세포살해능(CTL activity) 36
제5절 면역 활성 다당의 신속 분리방법 36
제1항 면역 활성 다당의 신속 분리방법을 이용한 청귤 과피 유래 다당의 분리 및 정제도 확인 36
제2항 구성당 분석 37
제3항 면역 활성 다당의 신속 분리방법을 이용한 청귤 과피 유래 다당의 IL-6 cytokine 측정 37
제6절 청귤 과피 유래 다당의 작용기작 규명 38
제1항 RAW 264.7 cell이 생산하는 chemokine 및 cytokine측정 38
제2항 iNOS 및 IL-6 유전자 발현 확인 38
제3항 Mitogen-activated protein (MAP) kinase와 NFκB pathway 활성화 확인 40
제4항 Inhibitor를 이용한 세부 기작 확인 41
제5항 시료가 결합하는 대식세포 pattern recognition receptor 확인 42
제7절 청귤 과피 유래 다당의 구조분석 43
제1항 일반분석 43
제2항 구성당분석 43
제3항 HPLC에 의한 분자량 측정 44
제4항 β-Glucosyl Yariv reagent를 이용한 arabino-β-3,6-galactan (type II)의 존재확인 44
제5항 Methyl화 분석에 의한 다당의 구조 및 결합 양식 확인 45
제8절 통계처리 47
제4장 결과 및 고찰 52
제1절 국내산 citrus 과피 유래 기능성 획분의 분리 및 활성 선별 52
제1항 시판 상업용 효소처리에 의한 조다당 분리 52
제2항 상업용 효소처리로 조제된 조다당 시료의 대식세포에 의한 cytokine 생산능 평가 52
제3항 Citrus 과피(감귤, 청귤, 한라봉) 유래 시간별 효소처리 조다당 최적 조건 확립 53
제4항 Citrus 과피(감귤, 청귤, 한라봉) 유래 시간별 효소처리 조다당의 대식세포의 cytokine 생산능 측정 54
제2절 청귤 과피 유래 다당의 분리, 정제 및 면역 활성측정 58
제1항 청귤 과피 유래 다당의 분리 및 정제 58
제2항 청귤 과피 유래 다당의 대식세포의 세포독성 및 cytokine 생산 유도 활성 측정 59
제3항 청귤 과피 유래 조다당 CCE-0와 정제다당 CCE-I에 대한 세포독성 및 cytokine 생산에 미치는 영향 60
제3절 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 정맥 투여를 통한 면역 활성과 항전이 효과 61
제1항 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 자연 살해 세포에 의한 살해 활성능 (NK cell activity) 61
제2항 종양 전이 세포주에 대한 독성 측정 62
제3항 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 정맥투여를 통한 항전이 활성 68
제4항 NK cell 기능이 억제된 mouse에서의 항전이 활성 68
제5항 세포독성 T 림프구(CTL)에 의한 종양전이주 살해능 측정 69
제4절 청귤 과피 유래 조다당 CCE-0의 경구투여에 의한 면역 활성과 항전이 효과 75
제1항 청귤 과피 유래 조다당 CCE-0의 경구투여에 의한 자연살해세포의 종양살해능 (NK cell activity) 75
제2항 청귤 과피 유래 조다당 CCE-0의 경구투여에 의한 항전이 활성 76
제3항 세포독성 T 림프구(CTL)에 의한 종양전이주 살해능 측정 77
제5절 청귤 과피 유래 조다당의 면역 활성 다당 신속 분리방법 81
제1항 면역 활성 다당의 신속 분리방법을 이용한 청귤 과피 유래 조다당의 분리 및 정제 81
제2항 청귤 과피 유래 용매분리 획분의 화학적 특성 및 정제도 확인 82
제3항 청귤 과피 유래 용매분리 획분의 대식세포 자극에 의한 IL-6 cytokine 생산능 83
제6절 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 세포 신호전달 작용기작 규명 88
제1항 청귤 과피 유래 정제다당 CCE-I에 의한 RAW 264.7 cell의 세포독성, cytokine 및 chemokine 측정 88
제2항 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I에 의한 iNOS 및 IL-6 유전자 발현 확인 89
제3항 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 MAP kinase 경로 활성화 92
제4항 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 NFκB 경로 활성화 95
제5항 Inhibitor를 통한 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 NO 및 IL-6 생산경로 분석 97
제6항 Inhibitor를 통한 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 세포 내 신호전달 세부 기작 98
제7항 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 대식세포receptor 경로 확인 101
제7절 청귤 과피 유래 면역 활성 정제다당 CCE-I의 구조규명 103
제1항 청귤 과피 유래 다당의 화학적 특성 및 β-Glucosyl Yariv reagent와의 반응성 확인 103
제2항 Methylation analysis에 의한 CCE-I 결합양 식 확인 105
제3항 청귤 과피 유래 정제 다당 CCE-I의 전체구조 추정 106
참고문헌 115
Abstract 121
Table 1. Analytical condition of high performance liquid chromatography... 48
Table 2. Analytical condition of high performance liquid chromatography... 49
Table 3. Analytical condition of gas chromatography (GC) for component sugar... 50
Table 4. Analytical condition of gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS) for... 51
Table 5. Sugar composition of the polysaccharide fractions obtained by... 86
Table 6. Chemical properties of CCE-0 and CCE-(I, II, III) isolated from... 107
Table 7. Glycosidic linkage analysis of CCE-I purified from cheongkyool... 113
Fig. 1. Isolation of crude polysaccharides from 4 types of pectinase digests... 27
Fig. 2. Isolation on crude polysaccharides according to different incubation... 28
Fig. 3. Isolation and purification of immunostimulating polysaccharides from... 31
Fig. 4. Effects of HCE-0-SPL, HCE-0-UP, HCE-0-PLA and HCE-0-PEC... 55
Fig. 5. Elution patterns of GCE-(3h, 6h, 12h), CCE-(3h, 6h, 12h) and... 56
Fig. 6. Effects of GCE-(3h, 6h, 12h), CCE-(3h, 6h, 12h) and HCE-(3h, 6h,... 57
Fig. 7. Gel filtration of CCE-0 fraction on the column of Sephadex G-100.... 63
Fig. 8. Effect of CCE-0, I, II and III on cell viability (A), interleukin (IL)-6... 64
Fig. 9. Effect of CCE-0 and CCE-I on cell viability (A), interleukin (IL)-6... 65
Fig. 10. Effect of i.v administration of CCE-I on cytolytic activity of NK... 66
Fig. 11. Cytotoxic effect of CCE-0 and CCE-I isolated from cheongkyool... 67
Fig. 12. Inhibitory effect by i.v. administration of CCE-I from cheongkyool... 71
Fig. 13. Effect of NK cell depletion on the anti-metastatic activities of... 72
Fig. 14. Effect of NK cell depletion on the anti-metastatic activities of... 73
Fig. 15. Effect of CCE-I from cheongkyool peels on the activation of... 74
Fig. 16. Effect of oral administration of CCE-0 on cytolytic activity (A),... 78
Fig. 17. Effect of oral administration of CCE-0 on lung metastasis produced... 79
Fig. 18. Effect of oral administration of CCE-0 from cheongkyool peels on... 80
Fig. 19. Preparation of polysaccharide fractions by solvent separation method using ethanol from pectinase... 84
Fig. 20. Elution patterns of CCE-0-series polysaccharides obtained by... 85
Fig. 21. Effect of the polysaccharide fractions prepared by... 87
Fig. 22. Effect of CCE-0 and CCE-I on cytotoxicity (A), nitric oxide (NO)... 90
Fig. 23. Effect of CCE-I on mRNA expression of IL-6 (A), TNF-α (B) and... 91
Fig. 24. Possible signaling pathways involving in macrophage activation by... 93
Fig. 25. Activation of MAP kinase pathway by treatment of CCE-I on RAW... 94
Fig. 26. Activation of NFκB pathway by treatment of CCE-I on RAW 264.7... 96
Fig. 27. Effect of the treatment of CCE-I and specific inhibitors on NO (A)... 99
Fig. 28. Effect of specific inhibitors of MAP kinase pathways on... 100
Fig. 29. Effect of treatment anti-PRR antibodies on NO (A) and IL-6 (B)... 102
Fig. 30. Elution pattern and MW-determination of CCE-I (A), CCE-II (B)... 108
Fig. 31. Single radial gel diffusion between β-glucosyl Yariv reagent and... 109
Fig. 32. Principle of methylation analysis for determination of sugar... 110
Fig. 33. Total ion chromatograms of GC-MS for partially methylated alditol... 111
Fig. 34. GC-MS fragment ion patterns of the characteristic linkages derived... 112
Fig. 35. Possible structure of CCE-I, immuno-stimulating polysaccharide purified from cheongkyool peels. 114
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