표제지

국문초록

목차

I. 서론 16

II. 재료 및 방법 24

1. 재료 24

1.1. 균주 24

1.2. 발효제 및 원료 24

1.3. 시약 24

2. 막걸리 양조효모 실험방법 25

2.1. 입국 당화액 제조 25

2.2. 효모균제 접종량 25

2.3. 알코올 생성능 및 향 생성능력 25

2.4. 최적 발효온도 설정 25

3. 막걸리 양조 25

4. 막걸리 양조효모 특성 분석 27

4.1. 형태학적 특성 27

4.2. 분리 미생물의 동정 27

4.3. 알코올 내성 및 내당성 28

4.4. 침강성 28

4.5. 탄소 이용능 29

4.6. 균체 지방산 29

4.7. 효소활성 30

4.8. In vitro 생리활성 32

5. 막걸리의 이화학적 특성 분석 33

5.1. 알코올 함량 33

5.2. pH 및 고형분 함량 34

5.3. 총산 34

5.4. 환원당 34

5.5. 유기산 34

5.6. 휘발성 화합물 35

5.7. 관능특성 분석 35

6. 막걸리 대사체 분석 35

6.1. 대사체 추출 35

6.2. 대사체 분석 36

7. 통계처리 36

III. 결과 및 고찰 38

1. 막걸리 양조효모 선발 38

1.1. 막걸리 양조효모 분리 38

1.2. 효모 Y197-13의 발효특성 40

1.3. 효모 Y197-13의 발효온도 설정 42

1.4. 효모 Y197-13의 양조특성 44

2. 균주 P. anomala Y197-13의 특성 48

2.1. 형태학적 성질 48

2.2. 분리 미생물의 동정 50

2.3. 내당성, 내알코올성, 침강성 55

2.4. 탄소 이용능 59

2.5. 균체 지방산 조성 63

2.6. 효소활성 65

2.7. In vitro 생리활성 67

3. 균주 Pichia anomala Y197-13의 막걸리 양조적성 69

3.1. 발효제별 양조적성 69

3.2. 온도별 양조적성 78

3.3. 급수량별 양조적성 93

4. 균주 Pichia anomala Y197-13 막걸리 특성 106

4-1. 이화학 및 관능특성 106

4-2. 휘발성 향기성분 113

4-3. 지방산 조성 115

4-4. In vitro 생리활성 117

4-5. 발효기간 동안 대사체 변화 119

4-6. 발효기간 중 확인된 대사체의 정성분석 129

4-7. 발효기간 중 확인된 대사체의 정량분석 135

IV. 결론 139

1. 균주 P. anomala Y197-13의 형태학적 특성 139

2. 균주 P. anomala Y197-13의 내알코올성, 내당성, 침강성 139

3. 균주 P. anomala Y197-13의 탄소원 이용능 140

4. 균주 P. anomala Y197-13의 지방산 구성 140

5. 균주 P. anomala Y197-13의 효소활성 및 in vitro 생리기능성 140

6. 균주 P. anomala Y197-13의 막걸리 양조적성 140

7. 균주 P. anomala Y197-13 막걸리의 지방산 및 in vitro 생리활성 142

8. 균주 P. anomala Y197-13 막걸리의 대사체 분석 142

9. 균주 P. anomala Y197-13 막걸리의 발효기간 중 대사체 정량분석 142

V. 참고문헌 144

Abstract 161

Appendix 165

Table 1. Gradient analysis condition for UPLC-Q-TOF MS 37

Table 2. 1st Brewing characteristics of the wild yeast strains for Makgeolli 41

Table 3. 2nd Brewing characteristics of the wild yeast strains for Makgeolli 47

Table 4. Morphological characteristics of the type strain(ATCC 24858) and the wild yeast strains(Y98-5 and Y197-13) 49

Table 5. Identification of the wild yeast strains Y98-5 and Y197-13 52

Table 6. Flocculence of the type strain(ATCC 24858) and the wild yeast strains(Y98-5 and Y197-13) 58

Table 7. Phenotype characteristics of the wild type yeast strains Y98-5 and Y197-13 61

Table 8. Fatty acid profiles of the wild yeast strains Y98-5 and Y197-13 64

Table 9. Enzyme activity of the wild yeast strains Y98-5 and Y197-13 66

Table 10. In vitro physiological activity of the wild yeast strains Y98-5 and Y197-13 68

Table 11. Organic acid contents of Makgeolli using Y98-5 and Y197-13 brewed with different fermentation agents 75

Table 12. Preference test for Makgeolli using Y98-5 and Y197-13 brewed with different fermentation agents 77

Table 13. Chemical contents of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the temperature 83

Table 14. Organic acid contents of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the temperature 85

Table 15. Volatile compounds of Y98-5 Makgeolli depending on the temperature 86

Table 16. Volatile compounds of Y197-13 Makgeolli depending on the temperature 87

Table 17. Preference test for Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the temperature 92

Table 18. Chemical characteristics of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the water-grist ratio 98

Table 19. Organic acid contents of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the water-grist ratio 99

Table 20. Volatile compounds of Y98-5 Makgeolli depending on the water-grist ratio 101

Table 21. Volatile compounds of Y197-13 Makgeolli depending on the water-grist ratio 102

Table 22. Preference test for Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the water-grist ratio 105

Table 23. Chemical characteristics of alcoholic beverage using Y98-5 and Y197-13 109

Table 24. Chemical characteristics of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 110

Table 25. Organic acid content of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 111

Table 26. Preference test for Makgeolli brewed using strains Y98-5 and Y197-13 112

Table 27. Volatile compounds of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 114

Table 28. Fatty acids of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 116

Table 29. In vitro physiological functionality of Makgeolli using yeast strains Y98-5 and Y197-13 118

Table 30. Identity and fold change of Makgeolli metabolite using yeast strains Y98-5 and Y197-13 during fermentation period 128

Table 31. Identification of Makgeolli metabolite in positive and negative mode by UPLC-Q-TOF MS 132

Table 32. Quantitative analysis of major matabolite in Y98-5 Makgeolli during fermentation time by UPLC-Q-TOF MS 137

Table 33. Quantitative analysis of major metabolite in Y197-13 Makgeolli during fermentation time by UPLC-Q-TOF MS 138

Fig. 1. Metabolite flux distributions in P. anomala 20

Fig. 2. Relationships of selected members of the Saccharomycetales 22

Fig. 3. Flow diagram of the steps used to brew Makgeolli 26

Fig. 4. Flow diagram of the steps used to select the wild yeast strains for Makgeolli 39

Fig. 5. Alcohol fermentation capacity of wild yeast strains at different fermentation temperatures 43

Fig. 6. Changes of pH(A) and soluble solid(B) in mash during fermentation 45

Fig. 7. Contig alignment coverage of the wild yeast strains Y98-5 AND Y197-13 sequences. F. ITS1 forward primer, R, ITS4 reverse primer 51

Fig. 8. Clustal multiple alignment of Pichia anomala Y197-13 and type strain AY046221. 54

Fig. 9. Phylogenetic tree of Pichia anomala Y197-13. 54

Fig. 10. Ethanol tolerance(A) and glucose tolerance(B) of the type strain(ATCC 24858) and the wild yeast strains(Y98-5 and Y197-13) 57

Fig. 11. Alcohol content(bars) and soluble solids(symbols) of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 with different fermentation agents. 70

Fig. 12. pH(bars) and total acids(symbols) of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 with different fermentation agents. 72

Fig. 13. Reducing sugar content of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5(A) and Y197-13(B) with different fermentation agents. 73

Fig. 14. Changes in pH of mash brewed using yeast strains Y98-5(A) and Y197-13(B) depending on the temperature. 79

Fig. 15. Changes in soluble solid of mash brewed using yeast strains Y98-5(A) and Y197-13(B) depending on the temperature. 80

Fig. 16. Alcohol contents of alcoholic beverage brewed using strains Y98-5 and Y197-13 depending on the temperature. 82

Fig. 17. Principal component analysis(PCA) of the 30 volatile compounds of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the temperature. 90

Fig. 18. Changes in pH of mash brewed using yeast strains Y98-5(A) and Y197-13(B) depending on the water-grist ratio. 94

Fig. 19. Changes in soluble solid of mash brewed using yeast strains Y98-5(A) and Y197-13(B) depending on the water-grist ratio. 95

Fig. 20. Alcohol contents of alcoholic beverage brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the water-grist ratio. 96

Fig. 21. Principal component analysis(PCA) of the 30 volatile compounds of Makgeolli brewed using yeast strains Y98-5 and Y197-13 depending on the water-grist ratio. 103

Fig. 22. Changes in pH(A) and soluble solid(B) of mash during fermentation time. 107

Fig. 23. Total metabolite of aligned compounds of MassHunter mass profiler prefessional(MPP). 120

Fig. 24. Total ion chromatogram(TIC) of alcoholic beverage using yeast strains Y98-5(A) and Y197-13(B) during fermentation period(1, 2, 3, 6, 7, 8 days). 121

Fig. 25. TIC of Koji, Makgeolli using yeast strains Y98-5 and Y197-13, and amino acid standard mixture. 122

Fig. 26. Validate model of Makgeolli using yeast strains Y98-5 and Y197-13 for PLS-DA. 124

Fig. 27. The score plot of PLS-DA for Makgeolli using yeast strains Y98-5(A), Y197-13(B) and Y98-5 with Y197-13(C) during fermentation period. 125

Fig. 28. Volcano plot of Makgeolli metabolite using yeast strains Y197-13 vs. Y98-5 during fermentation period. 126

Fig. 29. Mass fragmentation of identified metabolite. 133

 본 논문에서는 누룩에서 분리한 야생효모로부터 막걸리 특유의 탄산미, 바디감과 신맛을 생성하는 특성의 균주 선발작업을 수행하여 최종 선발된 10균주 중 관능특성이 우수한 균주 S. cerevisiae Y98-5를 대조균으로 하여 이와 유사한 관능특성을 갖는 P. anomala Y197-13 균주의 막걸리 제조를 위한 균학적 및 양조학적 특성을 분석하였다. 균주 Y197-13의 영양세포의 형태는 구형-난형이었으며 (3.0-5.0)×(3.5-6.5) µm의 크기였고 자낭포자는 1-4개를 형성했으며 colony는 흰색-미황색을 띠었고 위균사는 형성하지 않았다. 균주 Y197-13은 588 bp의 염기서열이 분석되었고 Pichia anomala AY046221과 98%의 유사성을 보였으며 GenBank에 Acession number JX566694로 등록되었다. 균주 P. anomala Y197-13의 알코올 생성은 25℃에서 가장 빨랐고 입국배지에서 상큼한 신향, 단내와 함께 과일 향이 감지되었으며 산막을 형성하지 않았다. 내알코올성은 에탄올 12%에서부터 생존율 60% 수준을 보였고 에탄올 20%에서는 39.6%로 급격히 저하되었다. 내당성은 포도당 40%에서 생존율 60% 수준을 보였고 포도당 60%까지 일정한 생존율을 보여 고당농도에 영향을 받지 않는 crabtree negative 효모로 확인되었다. 균주 P. anomala Y197-13은 침강성이 8.38%로 non-flocculent 효모에 속하였고 탄소원으로 단당류, 이당류뿐만 아니라 maltotriose, D-raffinose도 이용하였고 acetic acid, propionic acid를 약하게 이용하였다. 균주 P. anomala Y197-13의 균체지방산은 linoleic acid 33.94%, oleic acid 26.97%, palmitic acid 20.57%, linolenic acid 9.59% 그리고 palmitoleic acid 6.19%로 구성되었고 효모 P. anomala의 평균적인 지방산 구성과 비교해 oleic+linolenic acid는 최하의 경우보다 3.44% 낮은 구성이었고 palmitic acid는 최대의 경우보다 2.57% 높은 구성이었다. P. anomala Y197-13 균주의 protease, amylase, cellulase, polygalacturonase 효소활성은 기 보고된 결과와 같이 모두 낮았고 in vitro 생리활성은 α-glucosidase 저해활성이 43.2%로 항비만 활성이 있었고 미백과 혈전용해 활성은 없었으며 ACE 저해활성은 40% 수준으로 기 보고된 효모 P. anomala 의 저해활성보다 높았다. 균주 P. anomala Y197-13은 누룩이나 개량누룩을 사용한 경우보다 입국을 사용한 양조에서 알코올 생성이 11.1%로 높았고 고형분과 환원당 함량도 높았다. 유기산은 상큼한 신맛 특성의 citric acid 함량이 3.53 mg/mL로 매우 높았고 누룩, 개량누룩 사용구에서는 강한 신맛 특성의 lactic acid 함량이 매우 높았다. 균주 P. anomala Y197-13과 입국을 사용한 막걸리는 알코올 함량을 6%로 낮췄을 때 기존 막걸리에서 맛이 희석되는 단점을 보완하고 적당한 신맛을 나타내어 과일 향, 상큼함과 함께 탄산미가 감지되어 관능평가에서 6점으로 높은 점수를 얻었다. 균주 P. anomala Y197-13은 발효온도 25℃에서 최대 알코올 함량(13.4%)을 보였고 감칠맛 특성이 있는 유기산 succinic acid가 온도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 휘발성 향기성분은 과일 향 특성이 있는 ethyl caproate가 25℃ 발효에서 가장 높은 피크 면적이었고 고농도일 경우 불쾌감을 주는 ethyl acetate와 acetic acid는 15℃ 발효에서 가장 높은 피크 면적으로 검출되었다. 온도별 막걸리의 향기성분을 주성분 분석한 결과 발효온도 15℃와 나머지 온도와의 대비가 뚜렷하였고 관능평가는 25, 30℃ 발효시 향 특성과 단맛, 신맛 기호도가 좋게 나타났다. 균주 P. anomala Y197-13은 급수율 200%에서 최대 알코올함량(13.9%)을 보였고 총산은 급수율이 높아질수록 낮아지는 경향을 보였다. 급수율 200%에서의 총산 0.32%, 고형분 5%, 환원당 6.6 mg/mL 함량이 citric acid는 많고 acetic acid가 적으며 향기성분 ethyl caproate, ethyl caprylate가 높고 관능특성에서 향, 단맛, 신맛 특성이 우수하게 나타나는 급수율로 확인되었다. 균주 P. anomala Y197-13의 최적 발효제로 입국을 사용하고 원료 쌀의 200%로 급수하여 25℃에서 양조한 막걸리는 균주 S. cerevisiae Y98-5로 동일조건에서 양조한 막걸리와 유사한 이화학적 특성을 보이면서 당 및 총산 함량이 조금씩 높게 나타나 관능평가에서 우수한 결과를 얻었다. 양조한 막걸리의 지방산은 균주 P. anomala Y197-13와 S. cerevisiae Y98-5의 구성비가 유사하게 확인되어 막걸리에서는 균체지방산의 패턴과 매우 다른 결과를 보였다. 균주 P. anomala Y197-13 막걸리의 α-glucosidase 저해활성은 균주 자체보다 낮아졌으나 ACE 저해활성은 81.2%로 균주 자체의 활성보다 2배 이상 높게 측정되어 막걸리 제조시 항고혈압 활성 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다. UPLC-Q-TOF MS를 이용하여 발효기간 동안 유의적으로 차이(p〈0.05)를 보이는 82개의 대사체를 분석하였다. TIC의 1-2.5분에 막걸리 제조시 접종한 효모균체와 입국에 존재하는 곰팡이 균체에서 유래되는 adenine, guanine, hypoxanthine, xanthine 등과 arabitol, erythritol이 확인되었고 3.5-8.4분에 dipeptide, tripeptide가 확인되었으며 4.2-8.2분에 GABA 및 아미노산 17종이 확인되었다. PLS-DA한 결과 PC1에 의해 P. anomala Y197-13 막걸리와 S. cerevisiae Y98-5 막걸리가 구분되었고 volcano plot으로 fold change〉2.0과 p〈0.05로 유의적인 차이를 보이는 대사체를 발효기간별로 비교한 결과 발효종료 시점에서는 두 막걸리의 대사체가 유사해지는 경향을 확인하였다. 대사물질 glycerol 외 6종이 그룹간의 차이에 관여하는 주요물질로 동정되었고 정량분석 결과 균주 P. anomala Y197-13 막걸리에서는 phenylalanine 등의 7종 필수아미노산과 GABA, 기타 아미노산 9종 및 유기산 4종이 확인되었으며 발효기간과 함께 함량이 증가되는 양상을 보였다. 아미노산은 균주 P. anomala Y197-13 막걸리에서 glutamic acid 외 5종을 제외하고 모두 균주 Y98-5 막걸리보다 높은 함량이었으며 발효 초기 주요 아미노산은 leucine 외 3종이었고 발효 종료 시점에서는 alanine 외 2종의 함량이 높아져 주요 아미노산으로 확인되었다. 균주 P. anomala Y197-13 막걸리의 주요 유기산은 citric acid로 확인되었고 발효 7일째 최대치를 보였으며 S. cerevisiae Y98-5 막걸리보다 1.2배 높은 함량으로 검출되었다. 이상의 결과로, 본 연구에 사용된 균주 P. anomala Y197-13은 산막효모로 알려져 있는 기존의 P. anomala와 달리 균체 지방산 조성에서 불포화지방산 구성이 낮고 포화지방산 구성이 높아 막걸리 제조시 산막을 형성하지 않는 것으로 확인되었고 급수량 200%, 25℃ 발효시 총산과 acetic acid 함량이 적어 불쾌한 신맛이 감지되지 않고 높은 citric acid 함량에서 기인하는 상큼한 신맛이 감지되는 것으로 확인되었다. 균주 P. anomala Y197-13 막걸리의 대사체를 분석한 결과 S. cerevisiae Y98-5 막걸리와 대사물질이 유사하였고 아미노산 함량이 유사하였으며 in vitro 생리활성 평가결과 ACE 저해활성이 81.2%로 높게 측정되어 항고혈압 활성이 있는 막걸리 제조 가능성이 있는 것으로 확인되었다.