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목차
국문요약 8
I. 서론 11
1. 단백질가수분해효소에 대한 HG1의 저항성 기전 연구 11
2. HG115의 항암 활성에 관한 연구 14
II. 실험 재료 및 방법 17
1. 단백질가수분해효소에 대한 HG1의 저항성 기전 연구 17
가. 펩타이드의 합성 17
나. 펩타이드 조각들의 합성 및 정제 17
다. 세균배양액으로부터 단백질들의 추출 18
라. 사람의 상처조직액 수집 19
마. 항균 활성 분석 19
a. 실험균주 19
b. Broth dilution assay 20
c. Colony count assay 21
d. Radial diffusion assay 21
바. 단백질가수분해효소에 의한 항균 펩타이드의 가수분해 22
a. 단백질가수분해효소에 의한 항균 활성의 영향 22
b. C18 Reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)(이미지참조) 22
사. 세균배양액으로부터 추출된 단백질들과 사람의 상처조직액의 단백질가수분해 활성 23
a. 세균배양액으로부터 추출된 단백질들의 가수분해 활성 23
b. 사람 상처조직액의 가수분해 활성 24
아. 항균 펩타이드의 항-MRSA 활성에 대한 세균배양액 단백질들의 영향 분석 24
자. 항균 펩타이드의 항-MRSA 활성에 대한 사람의 상처조직액의 영향 분석 25
2. HG115의 항암 활성에 관한 연구 26
가. 펩타이드의 합성 26
나. 세포주들의 배양 26
다. Microtiter plate 내에서의 세포 배양 27
라. 세포증식 및 성장에 대한 측정 실험 28
마. YO-PRO-1/PI 이중염색법 28
바. 세포독성측정 실험 29
a. 유출된 LDH의 활성 측정 실험 29
b. PI 유입 실험 30
사. CD spectra 30
아. 세포막 성분들에 대한 HG115의 결합 분석 실험 31
자. 리포좀에 대한 효과 분석 실험 31
차. 주사전자현미경(Scanning electron microscopy) 32
III. 결과 34
1. 단백질가수분해효소에 대한 HG1의 저항성 기전 연구 34
가. 현재 상용중인 항생제들과 항균 펩타이드들의 항균 활성비교 34
나. Trypsin 가수분해에 대한 HG1의 저항성 36
다. Chymotrypsin 가수분해에 대한 HG1의 저항성 42
라. MMP-7 가수분해에 대한 HG1의 저항성 47
마. 세균배양액으로부터 분리된 단백질들에 대한 HG1의 안정성 확인 53
바. 사람의 상처조직액에 대한 HG1의 안정성 확인 60
2. HG115의 항암 활성에 관한 연구 66
가. 암세포 증식에 대한 HG115의 효과 66
나. HG115에 의해 유도된 암세포 사멸 경로의 확인 68
다. HG115에 의한 암세포 막 손상의 확인 70
라. Circular dichroism (CD) 분석 73
마. 세포막 성분들에 대한 HG115의 결합특이성 확인 75
바. 리포좀에 대한 HG115의 효과 77
사. 암세포와 정상세포의 막에 대한 HG115의 효과 79
IV. 고찰 81
1. 단백질가수분해효소에 대한 HG1의 저항성 기전 연구 81
2. HG115의 항암 활성에 관한 연구 87
참고문헌 90
ABSTRACT 102
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1. 단백질가수분해효소에 대한 HG1의 저항성 기전 연구
양이온 항균 펩타이드들은 현재 상용중인 항생제들에 대해 내성을 가지는 미생물들에 의해 발생하는 심각한 감염증들을 치료하기 위한 새로운 계열의 항생제 후보물질로서 많은 주목을 받아왔다. 그러나 항균 펩타이드들은 사람과 병원체로부터 유래된 단백질가수분해효소의 공격으로부터 영향을 받기 쉬운 구조를 가지고 있으며, 이러한 취약점은 항균 펩타이드를 치료제로서 개발하는데 있어 심각한 방해요소로 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 동해산 비단멍게 (Halocynthia aurantium)의 체액세포로부터 분리된 halocidin의 구조에서 도출된 HG1의 단백질가수분해효소에 대한 저항성 여부를 분석하였다. 먼저, trypsin 가수분해에 대한 HG1의 저항성 실험에서 HG1은 trypsin에 의해 특정 펩타이드 조각들을 형성하는 것으로 관찰되었으며, 생성된 펩타이드 조각들은 항-MRSA 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. Chymotrypsin, matrix metalloprotease-7 가수분해에 대한 HG1의 저항성 실험에서는 1시간 동안 반응시킨 후에도 가수분해 되지 않은 HG1과 항-MRSA 활성을 가지는 펩타이드 조각이 존재함을 확인할 수 있었다. 이는 HG1이 가지는 독특한 구조적 특징의 결과로서, 여러 종류의 단백질가수분해효소(trypsin, chymotrypsin, human matrix metalloprotease-7)와 일정시간 반응한 후에도 강력한 항균활성이 보존됨을 확인할 수 있었다. 다량의 단백질가수분해효소를 포함하고있는 Staphylococcus aureus와 Pseudomonas aeruginosa의 배양액 단백질들과 사람의 피부 상처조직액에 대한 HG1의 저항성 실험을 수행하였다. HG1은 S. aureus와 P. aeruginosa의 세균배양액 단백질과 1시간 동안 반응시킨 후에도 항균 활성을 유지하는 것으로 확인되었으며, MALDI-TOF 분석 실험을 통해 HG1은 세균배양액 단백질들과 반응후에 가수분해 되지 않거나, 가수분해가 되더라도 강한 항-MRSA 활성을 가지는 펩타이드 조각(Khal)을 생성하는 것으로 확인되었다. 사람의 피부 상처조직액에 대한 HG1의 저항성 실험에서 HG1은 4시간 동안 반응시킨 후에도 가수분해 되지 않고 구조를 그대로 유지하는 것으로 확인되었다. 지금까지 수행된 결과들을 바탕으로 HG1은 단백질가수분해효소들에 대해 저항성을 가지고 있다는 것이 증명되었으며, 이러한 HG1의 구조적 형태를 잘 이해할 경우 항균 펩타이드를 기초로 한 항생제 개발에 있어 본질적인 문제를 해결할 수 있는 유용한 방법들을 제공할 수 있을 것이라 사료된다.
2. HG115의 항암 활성에 관한 연구
본 연구에서는 앞서 수행된 연구들(단백질가수분해효소에 대한 HG1의 저항성 기전 연구)로부터 얻어진 펩타이드 조각의 항암 활성 및 암세포의 사멸기전에 관한 연구들을 수행하였다. HG115라 명명한 펩타이드는 HG1을 trypsin과 1시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 세 종류의 펩타이드 조각들 중 C-말단 부위에 4개의 아미노산(GVLA)만이 잘려진 동형이량체(15-15-mer) 구조의 펩타이드이다(Fig. 2A와 Table 4). HG115가 암세포들의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험에서 HG115의 농도가 증가할수록 정상세포의 증식에는 아무런 영향을 주지않는 반면 암세포들의 증식에는 영향을 주는 것으로 확인되었다. HG115에 의한 암세포의 사멸기전을 확인하기 위해 수행된 YO-PRO-1/PI 이중염색 실험에서 HG115는 암세포들의 괴사를 유발시켜 세포증식에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 이러한 사실을 보다 명확히 입증하기 위하여 LDH 유출실험과 PI 유입실험을 수행하였다. LDH 유출실험에서는 HG115의 농도와 암세포들과의 반응시간이 증가할수록 세포질로부터 유출된 LDH의 활성이 증가하는 것으로 확인되었으며, PI 유입실험에서도 마찬가지로 HG115와의 반응시간이 증가할수록 PI의 유입이 증가된 세포가 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 동일한 방법으로 수행된 정상세포에 대해서는 아무런 영향을 나타내지 않았다. 이러한 사실들은 HG115에 의한 세포막의 손상을 나타내는 증거 들이며, 세포막 손상에 의해 암세포들이 괴사가 발생했음을 추정할 수 있었다. 수용액 내에서 HG115의 구조를 분석하기 위한 CD spectra 실험에서 HG115는 수용액에서 α-helix 구조를 가지는 것으로 확인되었으며, 세포막 성분들에 대한 결합 특이성 확인 실험을 통해 암세포들의 외막에 특이적으로 발현되는 phosphatidylserine에 강하게 결합하여 인위적인 이온 채널을 형성한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 주사전자현미경 관찰을 통해 보다 자세히 관찰할 수 있었다. 본 연구결과들을 바탕으로 이종이식 마우스 모델(xenograft model)실험을 포함한 여러 추가적인 실험들이 진행되어, 암세포들에 대한 HG115의 활성이 좀 더 명확해진다면 현재 상용되고 있는 화학요법 제제들을 대체할 수 있는 치료제가 개발될 수 있으리라 판단된다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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