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표제지
국문초록
목차
1. 서론 13
2. 실험재료 및 방법 16
2-1. Cell cultures 16
2-1-1. HCT-116(p53 wt), HCT-116(p53-/-) 16
2-1-2. U-2OS, SAOS-2, A549, HT-29 16
2-2. RNA 분석 16
2-2-1. Total RNA isolation 16
2-2-2. Reverse transcription. 17
2-2-3. Taqman miRNA Reverse transcription. 17
2-2-4. Real time PCR 17
2-3. Genomic DNA purify 18
2-4. Target expression vector 제작 18
2-4-1. MiRNA target site, mutant target site insert와 vector 준비 18
2-4-2. Ligation 19
2-4-3. Transformation ＆ cloning 확인 19
2-5. MiRNA expression vector 제작 19
2-5-1. Pre-miRNA와 mutant pre-miRNA insert 준비(with U6 loop) 19
2-5-2. Pre-miRNA와 mutant pre-miRNA insert 준비(without U6 loop) 20
2-5-3. Pri-miR-192와 mutant pri-miR-192 insert 준비 20
2-5-4. Vector 준비 20
2-5-5. Cloning 21
2-6. Pri-miR-192 promoter cloning 21
2-6-1. Insert와 vector 준비 21
2-6-2. Ligation ＆ Transformation 21
2-7. Phenol extraction ＆ Ethanol precipitation 22
2-8. Transfection 22
2-8-1. DNA transfection by Lipofectamine™ 2000 22
2-8-2. DNA transfection by LT-1 22
2-8-3. DNA transfection by pEI 22
2-9. p53 활성화를 위한 chemical 처리 23
2-9-1. Doxorubicin 처리 23
2-9-2. Nutline-3 처리 23
2-10. Luciferase assay 23
2-11. CAT-ELISA assay 24
2-12. β-galactocidase assay 24
2-13. Western Blot 24
2-14. pAVQ adenovirus system 25
2-14-1. pAVQ pri-miR-192, mt pri-miR-192 cloning 25
2-14-2. Adenovirus recombination. 26
3. 결과 27
3-1. Cancer cell line에서 miR-192, -215 level 확인 27
3-2. MiR-192, -215 target 제작 및 확인 27
3-2-1. MiR-192, -215에 대한 target construct 제작 27
3-2-2. MiR-192, -215의 target construct 효율 확인 28
3-3. Pre-miRNA expression vector 제작 및 확인 28
3-3-1. Pre-miRNA expression vector 제작 28
3-3-2. U6+1 pre-miR-192, -215 with loop expression vector의 효율 확인 29
3-3-3. U6+1 pre-miR-192, -215 without loop expression vector의 효율 확인 30
3-3-4. 7SL pre-miR-192, -215 expression vector의 효율 확인 30
3-4. Pri-miRNA expression vector 제작 및 효율 확인 31
3-4-1. Pri-miRNA expression vector 제작 31
3-4-2. Pri-miRNA expression vector 효율 확인 31
3-4-3. Tet-on stable cell line 제작 31
3-5. p53 단백질 활성에 의한 miRNA level 변화 32
3-5-1. Doxorubicin에 의한 p53 activation 확인 32
3-5-2. p53 activation에 의한 miR-192 level 변화 33
3-6. Pri-miR-192 promoter region cloning 및 assay 33
3-6-1. Pri-miR-192 promoter region 33
3-6-2. Pri-miR-192 promoter assay 34
3-7. MiR-192 processing을 확인하기 위한 construct 제작 34
3-8. pAVQ adenovirus system 35
3-8-1. pAVQ pri-miR-192 cloning 35
3-8-2. Transient하게 transfection하여 효과 확인 35
4. 고찰 36
Abstract 64
참고문헌 66
Table 1. Sequence of used primers 41
Fig. 1. Region in genomicDNA and sequence of miR-192,-215 43
Fig. 2. Preview of miR-192,-215 pathway 44
Fig. 3. MiR-215 and miR-192 are reduced in colon cancers compared to normal counter parts 45
Fig. 4. Reporter constructs containing miR-192 and miR-215 target site 46
Fig. 5. Target site containing reporter is down- regulated by endogenouse miR-192, -215 47
Fig. 6. Construction of pre-miR-192,-215 expression vectors 48
Fig. 7. Effect of U6+1 pre-miR-192 expression vector with U6 loop in colon cancer cell line 50
Fig. 8. Effect of U6+1 pre-miR-192 expression vector with loop in non-colorectal cancer cell line 52
Fig. 9. Effect of U6+1 pre-miR-215 expression vector with U6 loop 53
Fig. 10. Effect of U6+1 pre-miR-192 expression vector without U6 loop 54
Fig. 11. Effect of 7SL pre-miR-192 expression vector 55
Fig. 12. Construction of pri-miR-192 expression vectors and Tet-on system 56
Fig. 13. Transient transfection of pri-miR-192 expression vector 57
Fig. 14. miR-192 level by p53 activation 58
Fig. 15. Promoter region was regulated by p53 status 59
Fig. 16. Confirm of pri-miR-192 processing by p53 status 60
Fig. 17. Transient transfection of pAVQ pri-miR-192 for adenovirus system 61
초록보기 더보기
MiR-192, -215의 expression은 tumor suppressor gene인 p53 단백질에 의해 조절된다고 보고되어 왔다. 또한 miR-192, -215의 발현이 정상적인 대장에서는 과발현하고 있지만, colon cancer로 발달되면서 발현 level이 감소한다고 알려져 있다. 따라서 본 학위논문에서 우리는 miR-192, -215의 expression이 colon cancer의 proliferation이나 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 또한 p53 단백질이 이전에 알려진 것과 같이 miR-192, -215의 transcription을 조절하는지를 확인하고, post-transcription 단계에서도 영향을 줄 수 있는지 확인하고자 하였다. 우리는 세포 내에 miR-192, -215를 expression시키기 위해 여러 가지 type의 expression vector를 만들었다. 먼저 U6 promoter와 7SL promoter를 이용하여 pre-miRNA를 expression시킬 수 있는 vector를 만들었고, CMV promoter를 이용하여 pri-miRNA를 expression시킬 수 있는 vector를 만들었다. 이러한 expression vector를 reporter가 포함된 target construct와 co-transfection하여 miRNA expression vector가 reporter construct에 작용하는 효과를 확인하였다. 각각의 expression vector들은 효과적으로 target을 down regulation하였고, 이 효과는 p53 단백질에 영향을 받지 않는 것으로 여겨진다. 또한 보고된 바와 같이 doxorubicin을 이용하여 p53 단백질을 activation시켰을 때 pri-miR-192와 mature miR-192 발현이 둘 다 증가하는 것을 확인하였고, 이것은 transcription 단계에서 p53 단백질에 의한 효과라 생각된다. 실제로 transcription 단계에서의 효과를 확인하기 위하여 pri-miR-192의 promoter construct를 제작하여 promoter assay를 수행하였고, p53 단백질과 MDM-2의 결합을 억제하는 nutlin-3에 의해 p53을 activation시켜 promoter activity가 증가하는 것을 확인하였다. 이 같은 결과로 p53 단백질은 miR-192, -215의 transcription을 증가시키고 processing이나 targeting에는 관여하지 않을 것으로 생각된다. 이상의 결과들은 pri-miR-192, -215와 pre-miR-192, -215가 p53 단백질의 영향을 받지 않고 일반적인 anti-tumoral genetic agents로써 이용될 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 추가적으로 이들을 therapeutic agent로 이용하기 위해 강력한 delivery system인 adenovirus shuttle vector에 cloning하였고, adenovirus를 이용하여 그 효과를 보고자 한다.
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