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국문초록
ABSTRACT
Contents
1. Introduction 13
1.1. Signal Transducing Adaptor Molecule1 (STAM1) 13
1.2. Ubiquitination 19
1.3. Endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) complexes and multivesicular bodies (MVBs) 28
1.4. Purpose of study 32
2. Materials and methods 35
2.1. Protein expression and purification 35
2.1.1. Vector selection for soluble expression of STAM1N191(이미지참조) 36
2.1.2. Stabilizing a STAM1N191 protein(이미지참조) 39
2.1.3. STAM1N191 and its mutants(이미지참조) 40
2.1.4. Mono-Ubiquitin and Di-Ubiquitin 42
2.2. UIM peptide synthesis 44
2.3. Isothermal titration calorimetry (ITC) experiments 44
2.4. STAM1-UIM and Ubiquitin complex structure modeling experiment 46
2.5. Nuclear magnetic resonance (NMR) experiments 48
2.5.1. Backbone resonance spectroscopy of STAM1N191(이미지참조) 48
2.5.2. NMR spectroscopy and structural calculation of STAM1-UIM 49
2.5.3. Mapping a UIM binding interfaces of ubiquitin 55
2.5.4. Mapping a ubiquitin binding interfaces of STAM1N191(이미지참조) 55
3. Results 57
3.1. Induction of soluble STAM1N191 protein and its stability 57
3.2. NMR spectroscopy of STAM1N191(이미지참조) 66
3.3. Solution structure of STAM1-UIM 73
3.4. STAM1-UIM/ubiquitin complex structure 76
3.5. Interaction between ubiquitin and STAM1-UIM peptide 80
3.6. Interaction between ubiquitin and STAM1N191(이미지참조) 83
3.7. Effect of UIM in STAM1 for ubiquitin binding 83
3.8. Binding affinity of monoUb on STAM1N191 and the role of hydrophobic residues of UIM in ubiquitin binding(이미지참조) 88
3.9. Binding affinity between diubiquitin and STAM1N191(이미지참조) 95
4. Discussion 98
5. Conclusion 104
6. References 106
7. List of Abbreviations 124
Figure 1. Modular organization of STAM1 protein. 14
Figure 2. Domain structures of STAM1 related proteins (STAM2-VHS domain). 17
Figure 3. Amino acid sequences and structure of ubiquitin. 21
Figure 4. Enzymatic cascade of substrate ubiquitination. 22
Figure 5. Forms of ubiquitination. 24
Figure 6. Structures of K48-diUb and K63-diUb. 27
Figure 7. Schematic overview of endocytic routes in mammalian cells. 31
Figure 8. Schematic organization of four-types of STAM1N191 constructs.(이미지참조) 38
Figure 9. Solubility test on four-types of STAM1N191 constructs.(이미지참조) 61
Figure 10. Inhibition of protease activity on STAM1N191 by protease inhibitors.(이미지참조) 62
Figure 11. Separation of protease by size exclusion chromatography. 65
Figure 12. Amino acid sequences and backbone resonance assignment of STAM1N191.(이미지참조) 69
Figure 13. Summarized secondary structure and {¹H}-15N heteronuclear NOE values of STAM1N191.(이미지참조) 71
Figure 14. The overlaid ¹H-15N HSQC spectra between VHS alone and STAM1N191.(이미지참조) 72
Figure 15. Solution structure of STAM1-UIM. 74
Figure 16. Sequence alignment of UIM containing proteins. 75
Figure 17. STAM1-UIM/ubiquitin complex structure. 78
Figure 18. STAM1-UIM binding sites on ubiquitin. 82
Figure 19. Ubiquitin binding site on STAM1N191W26A.(이미지참조) 86
Figure 20. Ubiquitin binding site of STAM1N191.(이미지참조) 87
Figure 21. ITC measurements between ubiquitin and several STAM1N191 constructs.(이미지참조) 94
Figure 22. ITC measurements between STAM1N191 and diubiquitins.(이미지참조) 97
초록보기 더보기
STAM1과 Hrs는 ESCRT-0 복합체를 이루며, 유비퀴틴에 의해 수식된 막단백질을 인지하여 라이소좀에서의 분해를 위한 ESCRT 시스템에 들여보내는 역할을 한다. STAM1은 두 개의 유비퀴틴 결합 도메인인 VHS와 UIM을 갖고 있다. 본 연구에서는, 핵자기공명과 등온열량측정법을 이용하여 STAM1-UIM의 3차구조와, 두 개의 유비퀴틴결합 도메인을 갖고 있는 STAM1의 191개 아미노말단 잔기(STAM1N191)의 유비퀴틴결합 특징 및 구조적 특징을 연구하였다. Backbone resonance assignments와 {¹H}-15N heteronuclear NOE 실험을 통해 VHS와 UIM이 구조를 가지지 않은 운동성이 매우 큰 루프로 연결된 것을 알 수 있었다. UIM은 양친매성의 알파나선 구조를 이루고 있었으며 중심에 위치한 소수성 잔기가 유비퀴틴결합표면을 이루며 양쪽에 양전하와 음전하를 띈 잔기가 인접해 있었다. 또한 결합모사법을 통해 구한 STAM1-UIM과 유비퀴틴 결합체의 구조는 UIM과 유비퀴틴 간의 부가적인 정전결합을 보여주었다. 돌연변이 단백질을 이용한 핵자기공명과 등온열량적정법을 통해 각각의 유비퀴틴이 STAM1 단백질에 동시에 결합하는 것을 알 수 있었다. STAM1 단백질의 VHS와 UIM의 유비퀴틴에 대한 결합해리 상수는 52.4 μM과 94.9 μM 이었으며, 이는 각각의 도메인을 분리하여 측정한 값보다 1.5 배 및 2.2 배 증가한 결합친화성을 보이는 것이었다. K63-유비퀴틴이합체는 K48-유비퀴틴이합체 보다 STAM1N191에 1.8배 강하게 결합하였다. 본 실험에서 구한 STAM1 단백질과 유비퀴틴의 결합친화성은 생리적 조건에 더 적합한 결과로 판단되며 이는 차후 라이소좀에서 분해되는 단백질들에 대한 ESCRT 시스템의 역할을 이해하는 데 있어서 매우 정확한 정보를 제공해 줄 것이다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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