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Title Page
Contents
Abstract 7
Abbreviations 14
I. INTRODUCTION 16
1. Epothilones 16
2. Epothilones and colon cancer cell growth 20
2-1. Colon cancer cell growth 20
2-2. Microtuble disruption and colon cancer cell growth 22
2-3. NF-κB and cancer cell growth 25
3. Atherosclerosis and neointimal hyperplasia 28
3-1. Neointimal hyperplasia 28
3-2. Mechanism of neointimal hyperplasia 29
4. Objectives 33
II. MATERIALS AND METHODS 35
1. Materials 35
2. Cell culture 36
3. Cell proliferation assay 37
4. Western blot analysis 38
5. Gel electromobility shift assay 39
6. In vitro kinase assays 40
7. Transfection and luciferase activities assay 41
8. Tubulin polymerization assay 43
9. Immunofluorescent assay 43
10. TUNEL Assay 44
11. Flow Cytometry analysis 46
12. Carotid artery injury model 46
13. Morphometric analysis 47
14. Immunohistochemical analysis 48
15. siRNA assay 49
16. Statistical analysis 49
III. RESULTS 50
1. Effect of epothilones on the proliferation of colon cancer cell 50
1-1. Effect of epothilones on the proliferation of SW620 54
1-2. Effect of epothilones on the proliferation of cell cycle progression of SW620 56
1-3. Effect of epothilones on the apoptosis of SW620 59
1-4. Effect of epothilones on the activation of NF-κB in SW620 61
1-5. Effect of epothilones on the activation of IKK in SW620 66
1-6. Effect of epothilones on the polymerization of microtubule in SW620 72
1-7. Effect of epothilones on the expression of apoptotic cell death regulatory proteins in SW620 77
2. Effect of epothilones on the proliferation of rat aortic smooth muscle cell 81
2-1. Effect of epothilones on the proliferation of VSMC 85
2-2. Effect of epothilones on the apoptosis of VSMC 89
2-3. Effect of epothilones on the nuclear accumulation of p53 in VSMCs 94
2-4. Effect of pifithrin-α or p53 siRNA on the expression and translocation into nucleus of p53 97
2-5. Effect of epothilones on the apoptosis of VSMC as well as activation of p53 and caspase-3 in the neointimal hyperplasia region 102
IV. DISCUSSION 107
V. REFERENCES 121
VI. SUMMARY IN KOREAN 143
Table 1. Effect of EPOs on VSMC cell cycle progression. 93
Fig. 1. Structures of the epothilones. 19
Fig. 2. Polymerization of tublin. 24
Fig. 3. Regulation of the cell cycle. 27
Fig. 4. Response of blood vessel as a complication of a reconstruction procedure or endarterectomy. 32
Fig. 5. Effect of epothilones on the cell viabilities of SW620 human colon cancer. 55
Fig. 6. Effect of epothilones on the cell cycle progression. 57
Fig. 7. Morphological changes and apoptotic cell death of SW620 treated with epothilones. 60
Fig. 8. Effects of epothilones on NF-κB activation in SW620 determined by gel mobility shift assay. 63
Fig. 9. Effect of epothilone on the NF-κB in SW620 cells determined by confocal microscope. 64
Fig. 10. Effect of epothilones on the IKK activation. 67
Fig. 11. Effect of IKK inhibitor and mutant IKKs on the epothilone-induced cell growth inhibition. 69
Fig. 12. Effect of IKK inhibitor and mutant IKKs on the epothilone-induced NF-κB (p50) translocation. 70
Fig. 13. Effect of epothilones on the tubulin polymerization. 74
Fig. 14. Effect of epothilones on the colocalization of β-tubulin and p50. 75
Fig. 15. Effects of epothilones, IKK inhibitor, and cell death regulatory protein inhibitor on the expressions of apoptosis regulatory proteins, NF-κB activation, and cell death. 79
Fig. 16. Effect of epothilones on the vascular smooth muscle cell proliferation induced by FBS and PDGF-BB. 88
Fig. 17. Effect of EPOs on the apoptosis induction of VSMCs. 91
Fig. 18. Effects of epothilones on the p53 expression and nuclear accumulation in VSMCs. 95
Fig. 19. Effects of p53 inhibitor and siRNA p53 on the epothilone-induced apoptosis and p53 expression. 98
Fig. 20. Effect of epothilones on the expression of Bax and caspase-3 activation in VSMCs. 101
Fig. 21. Effects of EPOs on the neointimal hyperplasia and VSMCs apoptosis of neointimal layer after balloon injury. 104
Fig. 22. Effect of epothilones on the activations of p53 and caspase-3 proteins in neointimal hyperplasia. 106
Fig. 23. Representative mechanisms of epithilone-induced apoptotic cell death in colon cancer cell and excessive VSMCs proliferation. 120
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Epothilone은 현재 항암제로 사용되고 있는 탁솔이나 탁소텔 등과 같이 Microtubule(미세소관)을 안정화시켜 세포분열을 억제함으로써 암 세포의 증식을 막아 줄 수 있는 물질이다.
혈관 평활근세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)의 증식은 동맥경화증의 주요 원인으로 알려져 있다. 따라서 본 논문에서는 Epothilone의 과도한 세포증식 억제 가능성을 이용하여 Human colon cancer SW620 세포와 혈관평활근세포(VSMC) 증식에 대한 억제효과와 작용 기작을 규명했다.
Epothilone B와 D를 처리한 군의 경우 대장암 세포를 농도의존적으로 저해하였으며 epothilone들에 의해 cell cycle이 arrest(G₂/M)되어 apoptosis가 일어났다. epothilone B와 D는 IkB kinase (IKKα and IKKβ)를 통해 IkB degradation을 유발시켜 NF-κB를 활성화 시켰으며 결과적으로 nucleus로 p50과 p65의 translocation을 일으켰다. 또한 epothilone B와 D은 β-tubulin polymerization과 p50/β-tubulin complex의 형성도 증가시켰다. IKK 저해제인 Sodium salicylic acid을 첨가하거나 IKKα 변이주를 사용하였을 때에 β-tubulin polymerization은 증가되지 않았으나 NF-κB dependent apoptotic cell death regulatory genes인 Bax, p53, caspase-3는 증가시켰다. Caspase-3 inhibitor, 사용 시 epothilone B-induced cell death와 NF-kB 활성을 감소 시켰다.
이상의 결과를 통해 NF-κB/IKK 신호가 tubulin polymerization에 비의존적으로 epothilone에 의해 유도되는 대장암세포 SW620 사멸에 중요한 역할을 담당하는 것을 알 수 있었다.
흰쥐경동맥 손상모델에서 Epothilone B와 D의 신생내막형성 억제효과와 흰쥐경동맥 평활근세포(VSMC)의 증식을 촉진 시키는 성장인자의 변화도 조사 하였다. 혈소판유래 성장인자인 PDGF-BB처리 시 apoptosis가 유도되지 않았으나, EPOs를 첨가한 실험결과 epothilone B와 epothilone D는 유의적으로 VSMC의 세포사멸을 유도하였으며 전형적인 세포사멸 염색사의 형태적 변화와 함께 세포의 원형화와 플레이트로부터 탈착이 관찰 되었다. EPOs 처리군의 경우 cell cycle이 arrest(G0/G₁)되어 apoptosis가 일어나는 것을 알 수 있었다. 또한 EPOs는 세포핵내의 p53발현을 증가시켰으며 이들 p53의 전좌(translocation)가 세포사멸의 주요한 요인임을 확인 하였다. 신호전달 연구를 통해 epothilone B와 D가 p53의 발현과 축적을 유도하였으며 p53조절 caspase-3와 Bax가 활성화 되는 것을 알 수 있었다. 이러한 현상은 Paclitaxel을 양성대조군으로 사용한 rat carotid artery ballooninjury model의 동물실험을 통해 epothilone B, D, 그리고 Paclitaxel 투여로 신생내막형성이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 epothilones의 신생내막형성억제 효과는 EPOs에 의해 활성화된 p53-dependent caspase-3 경로를 경유한 VSMC의 세포사멸에 기인함을 알 수 있었다.
참고문헌 (99건) : 자료제공( 네이버학술정보 )더보기
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