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표제지
국문요지
목차
Abbreviations 14
1. 서론 16
1.1. 연구 배경 16
2. 실험 21
2.1. Single Mutant AKmtE122K 제작 실험 21
2.2. 시약 22
2.3. 사용기기 22
2.4. 실험방법 23
2.4.1. Point mutant AKmtE122K 제작 23
2.4.2. Mutant AKmtE122K 발현 25
2.4.3. Mutant AKmtE122K 정제 26
2.4.4. Mutant AKmt 정량 27
2.4.5. AKmtE122K/M9 배양 및 발현 28
2.4.6. AKmtE122K의 정제 31
2.5. 효소활성 측정 37
3. 결과 및 고찰 39
3.1. NMR 실험 및 구조 연구 39
3.1.1. NMR sample 준비 39
3.1.2. 사용 소프트웨어 및 하드웨어 39
3.1.3. 단백질 구조 연구를 위한 준비 40
3.2. T₁, T₂, NOE 실험 41
3.2.1. Modelfree를 이용한 단백질 구조의 유동성 예측 63
3.3. 분자동역학 연구 71
3.4. ATP 및 AMP 결합 메카니즘 연구 76
4. 결론 106
참고문헌 111
ABSTRACT 113
Table 1. Comparison of conserved amino acids sequence at target regions for wild-type AKmt and mutant AKmtE122K 21
Table 2. Purification and quantitative analysis of wild-type AKmt and mutant AKmtE122K 36
Table 3. Comparative kinetic parameters myokinase, AKmt and Single Mutant AKmtE122K 38
Table 4. 1H-15N HSQC chemical shift of AKmt(이미지참조) 48
Table 5. 1H-15N HSQC chemical shift of AKmtE122K(이미지참조) 52
Table 6. Averaged the overall rotational correlation times 62
Table 7. Calculated R₁, R₂, τm values for AKmtE122K ATP and AMP binding 70
Table 8. Parameters of MD Simulation; GROMACS is an engine to perform molecular dynamics simulations and energy minimization 73
Table 9. 1H-15N HSQC chemical shift of AKmtE122K after ATP titration(이미지참조) 81
Table 10. 1H-15N HSQC chemical shift of AKmtE122K after AMP titration(이미지참조) 86
Table 11. 1H-15N HSQC chemical shift of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after ATP titration(이미지참조) 91
Table 12. 1H-15N HSQC chemical shift of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after ATP titration(이미지참조) 93
Table 13. 1H-15N HSQC chemical shift of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after ATP+AMP titration(이미지참조) 95
Table 14. 1H-15N HSQC chemical shift of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after AMP+ATP titration(이미지참조) 97
Table 15. Apparent Dissociation Constants of ATP and AMP to AKmtE122K 98
Table 16. The Dissociation constant of AKmtE122K after ATP titration 99
Table 17. The Dissociation constant of AKmtE122K after AMP titration 101
Table 18. The Dissociation constant of AKmtE122K after ATP+AMP titration 103
Table 19. The Dissociation constant of AKmtE122K after AMP+ATP titration 105
Figure 1. Ribbon diagram of the tertiary structure of the AKmt. 19
Figure 2. Alignment of the amino acid sequences of AK from Mycobacterium tuberculosis. 20
Figure 3. SDS-PAGE analysis of IPTG induced expression of AKmt by transformed E.coli, pAKmt/M9 29
Figure 4. SDS-PAGE analysis of IPTG induced expression of AKmtE122K by transformed E.coli, pAKmt/M9 30
Figure 5. Analysis of purified wild-type AKmt by SDS-PAGE 32
Figure 6. Analysis of purified AKmtE122K by SDS-PAGE 33
Figure 7. Elution profile of AKmt by imidazole gradient concentration form Ni-NTA affinity chromatography 34
Figure 8. Elution profile of AKmtE122K by imidazole gradient concentration form Ni-NTA affinity chromatography 35
Figure 9. Comparison of enzyme specific activity between myokinase, AKmt and mutant AKmt 38
Figure 10. AKmt 1H-15N HSQC/3D-HNCO Spectrum showing amino acid sequence connectivity(이미지참조) 46
Figure 11. 1H-15N HSQC spectral assignment of AKmt(이미지참조) 47
Figure 12. 1H-15N HSQC spectral assignment of AKmtE122K(이미지참조) 51
Figure 13. Superimposition of 1H-15N HSQC spectra of AKmt and AKmtE122K(이미지참조) 55
Figure 14. Chemical-shift perturbation of AKmt/AKmtE122K 56
Figure 15. R₁, R₂, and NOE relaxation parameters 57
Figure 16. R₁, R₂, and NOE relaxation parameters of ATP titration 58
Figure 17. R₁, R₂, and NOE relaxation parameters of AMP titration 59
Figure 18. R₁, R₂, and NOE relaxation parameters of ATP(saturation) and AMP(add) titration 60
Figure 19. R₁, R₂, and NOE relaxation parameters of AMP(saturation) and ATP(add) titration 61
Figure 20. The calculated overall rotational correlation times(τm) of AKmt and AKmtE122K with T₁/T₂ ratio. 62
Figure 21. Plots of the measured 15N relaxation parameters and their uncertainties as a function of residue number for the AKmtE122K(이미지참조) 67
Figure 22. Chemical shift changes of ATP,AMP binding AKmtE122K as function of residue numbers 68
Figure 23. Chemical shift changes of ATP+AMP,AMP+ATP binding AKmtE122K as function of residue numbers 69
Figure 24. 10ns time course backbone RMSD and residual RMSF of AKmt and AKmtSM 74
Figure 25. Stereoview of the PCA clusters 1 of eigenvector 75
Figure 26. Domain movement and equilibrium during Eadk catalysis 78
Figure 27. ATP binding domain and AMP binding domain 79
Figure 28. Chemical shift perturbation of ATP saturat edenzyme 80
Figure 29. ATP binding site residues 84
Figure 30. Chemical shift perturbation of AMP saturated enzyme 85
Figure 31. AMP binding site residues 89
Figure 32. NMR analysis of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after ATP titration 90
Figure 33. NMR analysis of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after AMP titration 92
Figure 34. NMR analysis of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after ATP+ AMP titration 94
Figure 35. NMR analysis of selected ATP and AMP binding sites for AKmtE122K after AMP+ATP titration 96
초록보기 더보기
Adenylate kinase(AK)는 ATP와 AMP사이에서 가역적 고에너지 인산화 작용을 촉매하여 ADP를 생성하는 효소(Mg·ATP + AMP↔Mg·2ADP)로서 에너지 물질대사와 nucleotide 합성에 관여한다. 진핵생물의 AK1과 Mycobacterium tuberculosis의 AK(AKmt)는 아미노산 서열에서 높은 상등성을 보이나, 활성에서는 AKmt가 AK1의 10%정도로 매우 낮다. AK1의 하전을 띤 아미노산이 효소활성 및 기질 친화도에 영향을 주는 것을 착안하여 유전자조합과 세포배양을 통해 AK1과 부분적으로 동일한 아미노산 서열을 갖도록 AKmt의 LID domain 중 음전하를 나타내는 Glu[122]를 양전하를 나타내는 lysine으로 변형시킨 단백질 생산하였다. SDS-Gelelectrophoresis와 Ni-chromatography를 이용하여 및 분리 정제하였으며 AKmt와 single mutant인 AKmtE122K의 활성을 비교한 결과 AKmtE122K가 2배 이상 높은 활성을 나타내었다.
아미노산의 서열분석, 화학적 이동, 구조결정을 위하여 1H,13C,15N-연관된 다핵다차원 HSQC, HNCA, HNCO , HSQC-TOCSY, NOESY NMR 실험 및 리간드 적정 실험을 수행하였으며, 단백질의 동력학적인 정보를 얻어내기 위하여 T1, T2, NOE 실험을 수행하였다. AKmt의 아미노산 서열 및 신호를 해석하고 AKmtE122K의 신호와 비교하였으며 얻어진 NMR 화학적신호를 이용하여 리간드 결합부위를 중심으로 결합상수 및 구조적인 변형 및 차이점을 알아보았다. LID domain 주위에 있던 V115~D135 아미노산 잔기가 약 0.1~0.3ppm정도의 화학적 이동이 변화를 관측하였다. T1, T2, NOE 이완 실험을 통해 P-loop와 Lid domain에 있는 아미노산 잔기들이 다른 아미노산 잔기들에 비해 운동성이 크다는 것을 알 수 있었다. 전체회전 상관시간의 평균값 τm을 측정하여 비교해본 결과 AKmtE122K가 AKmt보다 약 0.5 ns 차이가 있었으며 활성과 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다.
효소의 촉매 메커니즘에서 loop나 domain의 움직임은 촉매 활성의 변화에 영향을 미친다. NMR을 이용하여 촉매 과정동안 ATP LID domain과 AMP binding domain의 구조적 재배치가 일어나 열림 형태에서 닫힘 형태로의 변화가 발생하는 사실을 관측하였다. ATP, AMP, Inhibitor 및 Mg이온의 적정실험과 NMR 실험분석을 통하여 해리상수 Kd값을 측정하였다. ATP의 농도를 AKmtE122K에 포화시켰을 때 ATP LID domain에서 약 0.5μM 결합이 AKmt보다 더 잘 이루어지면서 구조적 변화가 일어나는 사실을 알 수 있었다. AMP를 포화시키면 AMP binding domain에서 0.1μM 결합이 더 잘 이루어지면서 열림 형태에서 닫힘 형태로의 구조적 재배치가 일어남으로써 촉매활성에 변화가 일어난다는 것을 NMR 실험과 분자동력학 연구를 통하여 알 수 있었다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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