표제지

목차

국문초록 14

1. 서론 16

가. 생물반응기의 모니터링 16

1) 중·대형 생물반응기의 모니터링 17

2) 소형 생물반응기의 모니터링 18

가) 진탕배양기 19

나) 마이크로플레이트 기반 생물반응기 20

나. 형광기반 센서 22

1) 광학 센서 22

2) 형광기반 센서 23

가) 용존산소(dO₂) 센서 23

나) 수소이온(pH) 센서 27

다) 용존이산화탄소(dCO₂) 센서 29

다. 형광 센서막 31

1) 용존산소 검출용 센서막 31

가) 고분자 기반 센서막 32

나) 졸-겔 기반 센서막 34

2) 수소이온 검출용 센서막 34

가) 고분자 기반 센서막 35

나) 졸-겔 기반 센서막 36

라. 연구목적 37

마. 참고문헌 38

2. 형광검출 시스템 54

가. 형광의 발생 및 검출 54

나. 형광검출 시스템의 구성 60

1) 시스템의 구조 60

2) 광원 62

3) 광학 필터 64

4) 광 검출기 66

다. 형광검출 시스템의 특성 67

1) 광학 필터의 신호 대 잡음비 67

2) Ru(dpp)32+및 HPTS용액의 형광세기 측정(이미지참조) 68

3) LED 종류에 따른 시스템의 성능 70

라. 다채널 소형 생물반응기 시스템의 제어 및 전자회로 72

마. 요약 75

바. 참고문헌 76

3. 마이크로플레이트 기반 생물반응기 시스템의 특성 78

가. 교반 시스템에 따른 산소전달 특성 79

1) 발효액의 교반 79

2) 미생물의 산소전달 속도 80

3) 산소전달계수 82

4) 교반속도와 방해판 형태에 따른 산소전달 실험 84

가) 재료 및 방법 84

나) 결과 및 고찰 86

나. 온도분포 특성 88

1) 재료 및 방법 89

2) 결과 및 고찰 92

가) 세라믹 히터를 이용한 온도제어 92

나) 면상발열체를 이용한 온도제어 94

다. 요약 96

라. 참고 문헌 97

4. 형광센서막의 제조 및 특성 100

가. 형광센서막의 구성 100

나. 형광염료에 의한 dO₂, PH 및 dCO₂의 검출 101

1) 형광염료를 이용한 dO₂의 검출 101

2) 형광염료를 이용한 pH의 검출 102

3) 형광염료를 이용한 dCO₂의 검출 103

다. 형광센서막의 제조 및 특성 104

1) 시약 및 재료 104

2) 용존산소 검출용 센서막 104

가) 루테늄(II) 복합체의 광학특성 104

나) 센서막의 제조 106

다) 결과 및 고찰 107

3) 수소이온 검출용센서막 112

가) HPTS의 형광 특성 112

나) 센서막의 제조 114

다) 결과 및 고찰 115

4) 용존이산화탄소 검출용 센서막 118

가) 이산화탄소 검출용 형광염료 118

나) 센서막의 제조 119

다) 결과 및 고찰 120

라. 요약 127

마. 참고문헌 128

5. 마이크로플레이트 기반 생물반응기의 미생물 발효에의 응용 133

가. 실험 방법 135

1) 재료 및 방법 135

가) 생물반응기 135

나) 미생물 및 배지 137

나. 생물반응기의 성능 137

1) 교반속도에 따른 미생물 발효 특성 138

2) 온도에 따른 미생물 발효 특성 139

다. 용존산소의 온라인 모니터링 141

1) E.coli DH5a 발효공정에서 용존산소의 온라인 모니터링 142

2) Bacillus cereus 318 발효공정에서 용존산소의 온라인 모니터링 144

라. pH의 온라인 모니터링 146

1) E.coli DH5a의 발효공정에서 pH의 온라인 모니터링 148

2) B.cereus 318 발효공정에서 PH의 온라인 모니터링 150

마. 용존이산화탄소의 온라인 모니터링 154

바. 세포농도의 온라인 모니터링 156

1) E.coli DH5a 발효공정에서 세포농도의 온라인 모니터링 156

2) B.cereus 318 발효공정에서 세포농도의 온라인 모니터링 158

사. 용존산소, pH 및 세포농도의 동시 온라인 모니터링 160

1) E.coli DH5a 발효공정에서 용존산소, pH 및 세포농도의 동시 온라인 모니터링 161

2) B.cereus 318 발효공정에서 용존산소, pH 및 세포농도의 동시 온라인 모니터링 164

아. 요약 166

자. 참고문헌 168

6. 마이크로플레이트 기반 소형 생물반응기를 이용한 발효배지의 최적화 170

가. 통계적 최적화 기법 172

1) 일시일원 실시법(One factor at a time method) 172

2) 요인배치법(Factorial design method) 172

3) 플라킷-버만 설계법(Plackett-Burman design method) 173

4) 반응표면법(Response surface method) 173

나. 재료 및 방법 174

1) 균주 및 배지 174

2) 발효 실험 174

다. 결과 및 고찰 177

1) E.coli DH5a의 배지 최적화 177

2) B.cereus 318의 배지 최적화 179

라. 요약 182

마. 참고문헌 183

7. 결론 186

부록 189

가. 다채널 형광검출기 189

나. LED housing 190

다. 전자회로도 191

1) 증폭회로 191

2) 마이크로 컨트롤러 192

라. 마이크로 컨트롤러 프로그램 193

Abstract 197

감사의 글 200

Table 1-1. Fluorescence indicators and supporting matrices for oxygen sensors. 26

Table 1-2. Fluorescence indicators and supporting matrices for pH sensors. 28

Table 1-3. Fluorescence indicators and supporting matrices for dissolved carbon dioxide sensors. 30

Table 1-4. Properties of some polymers for optical oxygen sensing membrane. 32

Table 3-1. Typical respiration rates of microorganisms and cells in culture. 82

Table 3-2. Comparison of KLa values determined on the basis of the glucose oxidation with different reciprocating agitation speeds at 25℃.(이미지참조) 88

Table 4-1. Amount of NaCl to adjust the total ionic strength of the stock solution A and B. (stock solution A(1.3799 g/L of NaH₂PO₄·H₂O), B(1.799 g/L of NaHPO₄·2H₂O)) 108

Table 6-1. Medium composition in E.coli DH5a cultivation for the medium optimization experiments. 175

Table 6-2. Medium composition in Bacillus cereus 318 cultivation for the medium optimization experiments. 176

Figure 1-1. Illustration of the trade off in information output versus high-throughput capability that currently exists for various cell cultivation devices at different scales. 19

Figure 1-2. Principle of optical oxygen detection by a fluorophore. 25

Figure 2-1. The mechanism of fluorescence. The initial excitation takes place between states of same multiplicity and in accord with the Franck-Condon principle. (E: energy, S0: ground state, S₁: excitation state,...(이미지참조) 55

Figure 2-2. Plot of brightness (ε*φ) vs the wavelength of maximum absorption (λmax) for some fluorophores. (ε: extinction coefficient, φ: quantum yield)(이미지참조) 57

Figure 2-3. Set-up of optical components for the fluorescence detection. 60

Figure 2-4. Set-up of fluorescence detection system. 61

Figure 2-5. Spectral output of light from a xenon lamp and Nd:YAG laser. The "relative output" axis is scaled arbitrarily for the two light sources. 62

Figure 2-6. Electroluminescence spectrum of LEDs. The emission peaks were about 410 nm, 470 nm and 650 nm, with FWHM of 14.5 nm, 23.6 nm and 25 nm. 64

Figure 2-7. Transmission spectra of two bandpass filters, BP-524-O and LW-590. 66

Figure 2-8. Set-up of a measurement device for the ratio of signal to noise (S/NR). 68

Figure 2-9. Fluorescence intensity of Ru(dpp)32+ and HPTS solution.(이미지참조) 69

Figure 2-10. Effects of system temperature on the fluorescence detection system with different Ru(dpp)32+ and HPTS solutions.(이미지참조) 70

Figure 2-11. Fluorescence intensity of different Ru(dpp)32+ and HPTS solutions with 3 mm LED and 5 mm LED(이미지참조) 71

Figure 2-12. Function of a micro-controller. 73

Figure 2-13. Flowchart of control and measurement units with a micro-controller. 74

Figure 3-1. Shaking system of the 24-well microtiter plate bioreactor. 80

Figure 3-2. Schematic diagram of a 24-well microtiter plate with different baffles. 85

Figure 3-3. Different baffle configurations in a 24-well microtiter plate. 85

Figure 3-4. Overall oxygen transfer rate (OTR) with shaking speeds for different types of baffles (A~I). 87

Figure 3-5. Relations between reciprocating agitation speed and shaking speed unit. 88

Figure 3-6. Different types of temperature-control systems for the microplate-based bioreactor with optical on-line monitoring system (MABOOMS) (R:multichannel microbioreactor, H:ceramic heater, PH:planer... 91

Figure 3-7. Temperature measurement in the chamber of the microplate-based bioreactor system. 92

Figure 3-8. Temperature distribution of the microplate-based bioreactor system using a ceramic heater. The temperature was controlled to 35 ℃. 94

Figure 3-9. Temperature distribution of the mlcroplate-based bioreactor using a planer type heater. The temperature was controlled to 35 ℃. 95

Figure 4-1. Dynamic luminescence quenching of the excited state of the Ru(dpp)32+(R) by molecular oxygen.(이미지참조) 102

Figure 4-2. Chemical formula of Ru(dpp)32+.(이미지참조) 105

Figure 4-3. 2D-fluorescence spectra of Ru(dpp)32+ with (A):0 % dissolved oxygen and (B):100 % dissolved oxygen.(이미지참조) 106

Figure 4-4. Schematic illustration of the optical dissolved oxygen sensing membrane on a well of 24-well microtiter plate. 107

Figure 4-5. Effects of pH on the dissolved oxygen sensing membrane. 109

Figure 4-6. Fluorescence intensity of the dissolved oxygen sensing membrane with ionic strength. 110

Figure 4-7. Relative fluorescence intensity of 0 % dissolved oxygen solution with the dissolved oxygen sensing membrane at different temperatures. Fluorescence intensity at 25 ℃ was set to 100 % as reference value. 111

Figure 4-8. Stability of the dissolved oxygen sensing membrane for three months. 112

Figure 4-9. The chemistry and spectroscopy of a HPTS pH fluorescence dye. (A) Structures of the neutral and ionized forms of HPTS are shown reacting reversibly with a solution containing protons. (B) The pH dependent... 113

Figure 4-10. 2D-fluorescence spectra of HPTS in the pH buffer solutions with (a) pH 4.0 and (b) pH 8.0. 114

Figure 4-11. Calibration curve of the pH sensing membrane at various pH solutions. 116

Figure 4-12. (a) Fluorescence intensity of a pH sensing membrane at different pH value and ionic strengths. (b) Effect of temperature on the pH sensing membrane. 117

Figure 4-13. Storage stability of a pH sensing membrane for three months. 118

Figure 4-14. (a) The Construction of a CO₂ Sensing film and (b) the reaction process between HPTS and CO₂ in the fluorescence principle for CO₂ sensing. 120

Figure 4-15. (a) Fluorescence intensity at ex 450 nm/ em 515 nm and (b) fluorescence spectra of the dCO₂ sensing membrane with various dissolved carbon dioxide solution. 122

Figure 4-16. Relative fluorescence intensity with different pH values. Fluorescence intensity at pH 7 was set to 100 % as reference value. 123

Figure 4-17. Fluorescence intensity of the dissolved carbon dioxide sensing membrane with different ionic strengths. 124

Figure 4-18. Effect of temperature on the dissolved carbon dioxide sensing membrane. 125

Figure 4-19. Storage stability of the dissolved carbon dioxide sensing membrane. 126

Figure 5-1. Schematic set-up of the MABOOMS. The microplate-based bioreactor is placed inside the MABOOMS and the chamber is closed. Four optical fiber bundle carry four different wavelengths of light to the bottom... 136

Figure 5-2. (a) Effect of reciprocating agitation speed in the MABOOMS on the growth of E.coli DM5a (30 ℃). (b) Comparison of cell growths in the shaking incubator(37 ℃, 180 rpm) and the MABOOMS. 139

Figure 5-3. Optical cell density of E.coli DH5a in the MABOOMS and the shaking incubator under different temperatures. (SI: shaking incubator, MBB: 24-well microplate-based bioreactor) 140

Figure 5-4. Calibration curve of dissolved oxygen sensing membrane at various dissolved oxygen concentrations. The calibration curve was validated with a commercial oxygen electrode(Thermo Co., USA). 142

Figure 5-5. Online monitoring of dissolved oxygen concentrations in E.coli DH5a cultivation with the MABOOMS. (■: fluorescence intensity, -: dissolved oxygen) 144

Figure 5-6. Online monitoring of dissolved oxygen concentrations in B.cereus 318 cultivation with the MABOOMS. (■: fluorescence intensity, -: dissolved oxygen) 146

Figure 5-7. Calibration curves of the pH sensing membranes at various pH buffer solutions. 147

Figure 5-8. Online monitoring of pH values in E.coli DH5a cultivation with the MABOOMS. (Row 1, 3, 5: E.coli DH5a cultivation, Row 2, 4, 6: blank sample without E.coli DH5a cultivation, ■: fluorescence intensity, -: PH) 149

Figure 5-9. Offline PH values in E.coli DH5a cultivation with the MABOOMS, the shaking incubator and the bioreactor. (MMB: microplate-based bioreactor, SI: shaking incubator, BR: bioreactor) 150

Figure 5-10. Online monitoring of pH values in B.cereus 318 cultivation with the MABOOMS. (Row 1, 3, 5: B.cereus 318 cultivation, Row 2, 4, 6: blank sample without B.cereus 318 cultivation, ■: fluorescence intensity, -: pH) 152

Figure 5-11. Offline pH values in B.cereus 318 cultivation with the MABOOMS, the shaking incubator and the bioreactor. (MBB: microplate-based bioreactor, SI: shaking incubator) 153

Figure 5-12. Online monitoring of dissolved carbon dioxide concentrations in E.coli DH5a and B.cereus 318 cultivations with the MABOOMS. 155

Figure 5-13. Online monitoring of reflectance(RF) at 650 nm and normalized reflectance(norm. RF＝I0-I I0) in E.coli DH5a cultivation with the MABOOMS. (I0: reflectance at initial time, I: reflectance at a time, -: reflectance 650 nm,...(이미지참조) 157

Figure 5-14. Offline measurement of the absorbance at 600 nm (i.e. optical density) in E.coli DH5a cultivation with the MABOOMS, shaking incubator and the bioreactor. (MBB: microplate-based bioreactor, SI: shaking... 158

Figure 5-15. Online monitoring of reflectance(RF) at 650 nm and normalized reflectance(norm. RF＝I0-I I0) in B.cereus 318 cultivation with the MABOOMS. (I0: reflectance at initial time, I: reflectance at a time, -: reflectance 650 nm,...(이미지참조) 159

Figure 5-16. Offline measurement of the absorbance at 600 nm (i.e. optical density) in B.cereus 318 cultivation with the MABOOMS, the shaking incubator and the bioreactor. (MBB: microplate-based bioreactor, SI:... 160

Figure 5-17. Schematic diagram of a 24-well microplate-based bioreactor with 4-divided sensing membranes. 161

Figure 5-18. Online monitoring of fluorescence intensity and reflectance for dO₂, pH and cell mass with the 4-divided sensing membranes in E.coli DH5a cultivation with the MABOOMS. (-: dO2, ■:norm. RF, ○: pH) 163

Figure 5-19. Online monitoring of fluorescence intensity and reflectance for dO₂, PH and cell mass with the 4-divided sensing membranes in B.cereus 318 cultivation with the MABOOMS. (-: dO2, ■:norm. RF, ○: pH) 165

Figure 6-1. Comparison between the shaking incubator and the MABOOMS for medium optimization. 172

Figure 6-2. Online monitoring of fluorescence intensity and reflectance for dO₂, pH and cell mass in E.coli DH5a cultivation with various medium components for the medium optimization using the MABOOMS. (■: dO2, -:... 178

Figure 6-3. Online monitoring of fluorescence intensity and reflectance for dO₂, pH and RF in B.cereus 318 cultivation with various medium components for the medium optimization using the MABOOMS. (■: dO2, -:norm. RF, ○: pH) 181

생물공정으로부터 제품을 생산하기 위해서는 여러 단계의 최적화 과정이 수반되지만, 현재의 생물공정의 개발은 대량처리 기술의 제약으로 생물반응기를 이용하여 배지조성이 미생물 생장과 제품생산에 미치는 영향을 평가하기 어렵다. 일반적으로 생물반응기는 시스템의 부피가 크고 고가의 장비로서 미생물 배양의 최적화를 위해 다채널로 구성하여 동시에 실험을 하기는 쉽지 않다. 그러므로 빠른 처리속도와 저가의 다채널 생물공정 기술을 개발하기 위해 본 논문에서는 광학 온라인 모니터링 시스템이 갖추어진 다채널 소형생물반응기 시스템(MABOOMS)을 개발하고 연구하였다.

우선 광증배관과 LED 기반의 형광검출 시스템을 개발하고, 그 특성을 연구하였다. 제작되어진 형광검출 시스템은 고휘도 LED를 광원으로 사용하였는데, 14.5에서 25 nm의 매우 좁은 FWHM값을 지니고 있어 형광물질, Ru(dpp)₃2+와 HPTS를 여기할 수 있는 충분한 에너지를 방출하였다. 개발된 형광검출 시스템을 이용하여 Ru(dpp)₃2+와 HPTS용액의 형광세기를 측정하였을 때 각각 0.01 mg/mL, 10 μM 이하의 낮은 농도에서도 검출이 가능하였으며, 시스템의 온도변화에 무관하게 일정한 측정값을 나타내었다. MABOOMS의 교반속도를 80~720 rpm으로 변화시켰을 때 산소전달속도는 약 113 mmol O₂/(mL·hr)로 나타났으며, 산소전달계수는 약 600 1/hr으로 거의 변화가 없었다. 이는 기존의 중·대형 생물반응기에서보다 약 2배에 가까운 산소전달계수를 보인 것으로 외부에서 강제적인 공기유입 없이 미생물을 발효시킬 수 있을 정도로 충분함을 보였다. 또한 면상발열체를 이용한 다채널 소형생물반응기의 항온 성능은 오차가 0.001%로써 매우 낮은 값을 보였으며, 설정온도를 1℃미만의 오차로 제어가 가능하였다.

MABOOMS를 위한 형광센서막의 제조와 특성을 연구하였다. MTMS 졸-겔 기반의 광학 용존산소 검출용 센서막과 광학 pH 검출용 센서막을 제조하였으며, 선택적 이산화탄소 기체 투과막인 실리콘막을 센서 외막으로 구성하고 poly-HEMA를 사용한 광학 용존이산화탄소 검출용 센서를 제조하여 물리·화학적 특성을 조사하였다. 광학 용존산소 검출용 센서막은 pH 변화에 약 7% 미만의 오차를 보였으며, 이온강도가 증가할수록 형광세기가 감소하였다. 또한 측정온도가 10℃ 상승 할 경우 센서의 감도는 5% 감소하였다. 광학 pH검출용 센서막의 경우 pH 3에서 pH 10까지의 검출범위를 나타내고, 낮은 이온강도에서 높은 선형성을 보였다. 광학 용존이산화탄소 센서의 경우, 21.3 mg/L에서 425.59 mg/L의 길은 용존이산화탄소 농도 범위에서 사용할 수 있으며, pH, 이온강도 그리고 외부온도 변화에는 영향을 받지 않았다.

MABOOMS의 성능을 평가하기 위해 시스템의 교반속도 및 온도에 대한 미생물의 생장특성을 고찰하였다. 용존산소농도, pH, 용존이산화탄소농도 그리고 세포농도(반사도) 검출용 광학센서막이 웰 바닥면에 코팅된 24-웰 마이크로플레이트 기반 생물반응기를 이용하여 대장균과 고초균의 발효실험을 하면서 용존산소농도, pH, 용존이산화탄소농도 그리고 세포농도의 온라인 모니터링을 실시하였다. 대장균과 고초균의 발효 중 용존산소농도, pH, 용존이산화탄소농도 그리고 세포농도의 모니터링은 중·대형 생물반응기 및 진탕배양기를 이용한 발효와 거의 유사한 모니터링 결과를 얻을 수 있었다.

MABOOMS를 이용하여 대장균과 고초균의 발효배지의 최적화를 위한 모의실험을 수행하였다. 광학센서를 이용한 모니터링에 용존산소농도, pH 그리고 세포농도의 변화 곡선은 각각의 미생물 즉, 대장균과 고초균의 성장경향과 매우 유사하게 나타나 실제 미생물 배지최적화 실험에 적용할 수 있음을 확인하였다.